Den epigenetiska regulatorn BRD4 är involverad i kadmiumutlöst inflammatorisk respons i råttnjure

för mer information:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

Cistanche tubulosa förhindrar njursjukdom, klicka här för att fåprodukter och Cistanche DHT

ABSTRAKT

Kadmium (Cd) har beskrivits som en potentiell inflammatorisk inducerare samtidigt som allt fler bevis visar att olämplig inflammation är en bidragande faktor tillnjurskada. Därför är forskning om Cd-utlöst inflammatorisk respons av stor betydelse för att klarlägga mekanismen för Cd-inducerad nefrotoxicitet. Bromodomain-innehållande 4(BRD4) är en viktig epigenetisk regulator involverad i utvecklingen av många inflammatoriska sjukdomar, men dess reglerande roll i Cd-utlöstinflammatorisksvar återstår att klargöra. Här fann vi att behandling med Cd hos Sprague-Dawley-råttor (2 mg/kg kroppsvikt, ip, 5 dagar i följd) och hos råttanjurcelllinje (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) inducerade transkriptionen av inflammatoriska cytokiner, som kunde reduceras av JQ1 (BRD4-hämmare, 25 mg/kg kroppsvikt, ip , 3 dagar i följd in vivo; 0,5 μM, 12 timmar in vitro) eller BRD4 litet störande RNA (siRNA, in vitro), vilket tyder på att BRD4 deltar i Cd-utlöst inflammatoriskt svar. Därefter klargjorde vår studie rollerna för BRD4 i Cd-utlöst inflammatoriskt svar. Hämningen av BRD4 minskade Cd-främjad NF-KB nukleär translokation och aktivering in vivo och in vitro. Cd ökade acetyleringsnivån av RelA K310 och förbättrade BRD4-bindningen till acetylerad NF-KB RelA in vivo och in vitro, som upphävdes genom att hämma BRD4. Sammanfattningsvis föreslår vår studie att BRD4 är involverad i Cd-utlöst transkription av inflammatoriska cytokiner genom att förmedla aktiveringen av NF-KB-signalvägen och öka sig själv bindningen till acetylerad NF-KB RelA hos råttanjure,därför skulle BRD4 kunna vara ett potentiellt terapeutiskt mål för Cd-inducerade njursjukdomar.

Nyckelord: BRD4KadmiumNjure Inflammatoriskcytokiner NF-KB JQ1

1. Introduktion

Kadmium (Cd) är en tungmetallförorening med hög toxicitet och lång halveringstid. Med utvecklingen av industriell produktion har det ökade hotet från Cd-föroreningar mot miljösäkerhet och människors hälsa väckt oro (Wang et al., 2020; Horiguchi och Oguma, 2016). Efter att det har absorberats av kroppen, inducerar Cd skador på flera organ ochnjureär det huvudsakliga målorganet (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Tidigare har vi systematiskt verifierat att autofaginhibering, oxidativ stress och apoptos synergistiskt bidrar till Cd-orsakad nefrotoxicitet hos råttor (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Inflammation är ett fysiologiskt svar som fungerar som en defensiv reaktion mot infektion eller skada, men Cd-inducerade okontrollerade och olämpliga inflammatoriska reaktioner kan orsaka skada som att skada normal vävnad för åskådare och främja autoimmuna sjukdomar (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). Cd-utlöst inflammatoriskt svar förvärrade hjärt-kärlsjukdomar och leverskador, vilket tyder på att inflammation kan spela viktiga roller i Cd-medieradnjurepatologiska processer (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetik hänvisar till ärftliga modifieringar i genuttryck baserade på icke-DNA-sekvensförändringar, och reversibiliteten av dessa modifieringar möjliggör upptäckten av nya terapeutiska mål (Vendetti och Rudin, 2013). Bromodomain och extra-terminal domän (BET) familjen inkluderar bromodomain-innehållande 2 (BRD2), BRD3, BRD4 och bromodomain testis-specific (BRDT), som kännetecknas av två bromodomains och bindning till acetylerade lysiner av histoner och icke-histon ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee och Bohmann, 2018). BET-proteiner fungerar som transkriptionell co-aktivator av många gener och reglerar således cellcykeln, inflammatorisk respons, oxidativ stress och andra fysiologiska processer i olika patologiska modeller (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 är en särskilt välstuderad medlem av BET-proteinfamiljen, och ackumulerande undersökningar har rapporterat att det är ett nytt epigenetiskt mål för att reglera olikanjursjukdomar, inklusive kronisk nefrit, diabetisk nefropati och experimentell njurskada (Zeng och Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). BRD4 har bekräftats delta i den nukleära faktor-κB (NF-κB)-beroende transkriptionsprocessen för att reglera inflammatoriska svar i många sjukdomar (Xu och Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 kan rekryteras av acetylerad RelA (NF-KB-subenhet, en proteinkodande gen) vid lysin 310 (RelA-K310ac) via dess bromodmän, vilket aktiverar cyklinberoende kinas 9 (CDK9) och fosforylerar RNA-polymeras II för att främja transkription av NF-KB-målgener (Hajmirza et al., 2018). Nyligen genomförda studier tyder på att BRD4-hämmare kan vara ett potentiellt terapeutiskt alternativ för inflammatoriska sjukdomar. I modeller för ryggmärgsskada hos råtta dämpade hämning av BRD4 det inflammatoriska svaret och främjade den funktionella återhämtningen av mikroglia (Dey et al., 2019). Hämning av BRD4 upphävde också experimentell njurinflammation i murina modeller av unilateral ureteral obstruktion, antimembranbasal GN och infusion av angiotensin II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Med tanke på de potentiella pro-inflammatoriska effekterna av Cd och de reglerande effekterna av BRD4 på inflammation, antog vi att BRD4 är involverad i Cd-utlöst inflammatoriskt svar. Som förväntat förmedlar BRD4 transkriptionsprocessen av inflammatoriska cytokiner i Cd-exponerade råttnjurmodeller. Vår studie avslöjar en potentiell mekanism i det Cd-utlösta inflammatoriska svaret och ger nya insikter i behandlingen av Cd-inducerad nefrotoxicitet.

2. Material och metoder

2.1. Kemikalier och antikroppar

Kadmiumklorid (CdCl2, vattenfri, 439800) köptes från Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). (plus)-JQ1 (HY-13030) erhölls från MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Ett nukleärt proteinextraktionskit köptes från Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kina, P0027). Ett effektivt kemiluminescenskit (ECL, 32209) och bicinchoninsyraproteinanalysreagens (BCA, 23225) erhölls från Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Primära antikroppar mot följande proteiner användes: NF-kB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) köptes från Proteintech Group (Wuhan, Kina); -aktin (3700 s), Histone H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normal kanin-IgG (IgG, 4394) köptes från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); BRD4 (ab128874), K (lysin) acetyltransferas 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-KB RelA (acetyl K310) (RelA-K310ac, ab 19870), Alexa Fluor® 488-konjugerad (konjugerad åsna3 anti-rab7ab) var 1500bitar 3 anti-rabbitar från Abcam (Cambridge, Storbritannien). Andra antikroppar: Get Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) och Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) köptes från Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA ).

2.2. Djur och experiment

Tjugofyra Sprague-Dawley-råttor (hane, 6 veckor gamla, 110–120 g) köptes från Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Kina). Råttorna fick fri tillgång till mat och vatten i ett miljökontrollerat rum (24 ± 5 ​​grader, 12 timmars ljus/mörker-cykel). De experimentella förfarandena var tillämpliga på Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv 2010/63/EU för djurförsök, och alla förfaranden godkändes av Yangzhou University Animal Care and Use Committee. Efter en veckas acklimatisering delades råttorna slumpmässigt in i fyra grupper: (1) Kontrollgrupp: injicerades intraperitonealt med motsvarande lösningsmedel (fysiologisk saltlösning eller 2-hydroxipropyl- -cyklodextrinlösning). (2) Cd-grupp: CdCl2 (2 mg/kg kroppsvikt, löst i fysiologisk saltlösning) injiceras intraperitonealt under 5 dagar i följd för att etablera Cd-förgiftningsmodellen. (3) Cd plus JQ1-grupp: CdCl2 (2 mg/kg kroppsvikt) injiceras intraperitonealt under 5 dagar i följd för att etablera Cd-förgiftningsmodellen, och JQ1 (25 mg/kg kroppsvikt, löst i 2-hydroxipropyl{{ 25}}cyklodextrinlösning) injiceras intraperitonealt dag 6–8. (4) JQ1-grupp: JQ1 (25 mg/kg kroppsvikt) injiceras intraperitonealt dag 6–8. Statistik över Cd-innehåll i råttserum och njurvävnad listades i Tabell S1, vilket återspeglar den framgångsrika etableringen av Cd-exponerade råttmodeller.

Efter 8 dagars behandling dödades råttorna genom cervikal dislokation under djup anestesi efter 12 timmars fasta. Njurvävnaderna dissekerades och 1 g vävnad av varje njure lagrades snabbt vid -80 ◦C för att följa western blot och kvantitativ PCR (qPCR)-analys. Den återstående mängden vävnad fixerades snabbt i 4 procent paraformaldehyd (PFA) för immunhistokemisk (IHC) färgning.

2.3. Cellodling och behandling

Råttnjurcellinjen (NRK{{0}}E) erhölls från Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. NRK-52E-celler odlades med Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM, Gibco, 12800-017) innehållande 5 procent fetalt bovint serum (FBS, Gibco, 10437-028), penicillin och streptomycin (1 00 U/mL) i ett fuktigt tillstånd med 5 procent CO2 och 95 procent luft vid 37 grader . CdCl2 (ultraprent vatten-upplöst) och JQ1 (dimetylsulfoxid-upplöst) förvarades separat vid 4 grader och -20 grader och späddes ut i arbetslösningar före användning. Den experimentella designen var som följer: (1) Celler behandlades med 0, 2,5, 5, 10 μM Cd under 12 timmar eller 5 μM Cd under 0, 6, 12, 24 timmar för att utföra de efterföljande analyserna. (2) Celler behandlades med 5 μM Cd och/eller 0,5 μM JQ1 i 12 timmar för att utföra de efterföljande analyserna. (3) Celler transfekterades med siBRD4 och/eller behandlades med 5 μM Cd i ytterligare 12 timmar för att utföra de efterföljande analyserna.

2.4. Liten störande RNA-transfektion

Vi transfekterade 20 nM BRD4 litet störande RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) in i NRK-52E-cellerna med Lipofectamine RNAiMAX transfektionsreagens (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) i 24 timmar enligt produktmanualerna. Följande sens siRNA användes:

siBRD4, med en målsekvens av 5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3';

siCt (negativ siRNA-kontroll), med en målsekvens på 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Njurvävnadsprover och NRK-52E-celler lyserades i RIPA-buffert innehållande proteashämmare för att extrahera totalt protein. Kärnproteinet bereddes från färska vävnader och celler i förväg och lagrades vid -80 grader. Proteinprover (20–30 ug per prov) separerades med SDS-PAGE-elektrofores och överfördes sedan till polyvinylidenfluoridmembranen (Millipore, ISEQ00010). Membranen blockerades med 5 procent skummjölk i 90 minuter och inkuberades 12 timmar vid 4 grader med följande primära antikroppar: -aktin (1:5000), NF-kB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Därefter tvättades membranen med TBST och inkuberades med motsvarande sekundära antikroppar (1:10000) under 90 minuter vid rumstemperatur (RT). Membranen inkuberades med elektrokemiluminescens (ECL, ThermoFisher Scientific) och bestämdes på Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Frankrike), och den optiska densiteten analyserades med ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Immunfluorescens (IF) färgning

NRK{{0}}E-celler som såddes i en 24-brunnsplatta odlades till cirka 60 procents sammanflöde. Cellerna behandlades med 5 μM Cd och/eller 0,5 μM JQ1 i 12 timmar, fixerades sedan med PFA (4 procent, 10 min), permeabiliserades med Triton X- 100 (0,1 procent, 15 min), blockerades med BSA (2 procent, 90 min) vid RT, och inkuberades med primär antikropp (NF-KB p65, 1:50 spädning) över natten vid 4 grader. Efter att ha tvättats med PBS tre gånger, inkuberades cellerna med sekundär antikropp (1:500 utspädning) i 90 minuter och med DAPI i 5 minuter vid RT, sedan observerades cellerna under ett konfokalt mikroskop. NF-KB nukleär translokation analyserades i tre oberoende studier.

2.7. qPCR

Det totala RNA från njurvävnad och NRK-52E-celler extraherades med RNAiso Plus-kit (Takara Bio, Shiga, Japan). 1 ug totalt RNA användes för att syntetisera 1:a kedjans cDNA enligt tillverkarens manual (Roche, Basel, Schweiz). 2 μL komplementärt DNA (cDNA) per brunn togs för att detektera de relativa mRNA-nivåerna med hjälp av ett LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). Beräkna de relativa mRNA-nivåerna enligt ekvation 2-△△CT. Primers listades i tabell S2. -aktin var en råttreferensgen.

2.8. Samimmunutfällning (Co-IP)

Njurvävnaderna och NRK-52E-cellerna lyserades i nypreparerad cellysbuffert (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 procent Triton X{{8} }) som innehåller PMSF. Protein G-pärlor (100 μL per prov, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) blandades med 2 ug BRD4, RelA-K310ac eller IgG-antikropp per prov och roterades i 10 minuter vid RT. Sedan inkuberades de totala proteinlysaterna med pärlor-antikroppskomplex över natten vid 4 grader. Efter att ha tvättats med cellysbuffert tre gånger återsuspenderades immunfällningarna med 1 x SDS PAGE-provbuffert för att konfigurera proverna. Målproteinerna detekterades med hjälp av western blotting med anti-BRD4 och anti-RelA K310ac primära antikroppar.

2.9. Statistisk analys

Alla data erhölls från minst tre oberoende experiment och uttrycktes som medelvärde ± SEM om inte annat nämns. Experimentella grupper jämfördes med oparade tvåsidiga Students t-test eller envägsvariansanalys (ANOVA) med SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Signifikansen sattes till p <>

3. Resultat

3.1. Cd inducerar uttrycket av inflammatoriska cytokiner in vivo och in vitro

Som en miljöförorening har Cd visat sig orsaka njurskador genom att reglera en rad biologiska processer (Wang et al., 2019c). I denna studie undersöktes förändringarna i transkriptionsnivåerna av inflammatoriska cytokiner efter Cd-exponering för att undersöka om inflammation är involverad i Cd-inducerad nefrotoxicitet. Data visade att Cd-exponering signifikant ökade interleukin (IL)-1 och tumörnekrosfaktor (TNF)-proteinnivåer i NRK-52E-celler (Fig. 1A-B) och råttnjurvävnad (Fig. 1C) -D). Samtidigt, som visas i Fig. 1E-F, ökade Cd-exponering transkriptionsnivåerna av inflammatoriska cytokiner (IL-1, IL-6, TNF- och (Monocyt kemoattraktant protein-1) MCP -1) in vivo och in vitro. Dessa fynd tyder på att Cd inducerar uttrycket av inflammatoriska cytokiner i råttnjurar.

3.2. BRD4 deltar i den Cd-inducerade transkriptionsprocessen av inflammatoriska cytokiner

BRD4 är en nybeskriven epigenetisk regulator som binder till acetylerade histoner eller icke-histoner för att reglera inflammationsprocesser i många sjukdomar. Här användes BRD4-hämmare JQ1 och BRD4-siRNA för att undersöka rollen av BRD4 på Cd-utlöst inflammatoriskt svar. Data visade att Cd-förhöjda IL-1- och TNF-proteinnivåer nedreglerades av JQ1-behandling in vivo och in vitro (Fig. 2A-D) och genom BRD4-knockdown in vitro (Fig. S1A-B). Samtidigt hämmade JQ1-behandling signifikant Cd-förstärkta transkriptionsnivåer av IL-1, IL-6, TNF- och MCP-1 i NRK-52E-celler (Fig. 2E) och njurvävnader från rått (Fig. 2F). Dessutom minskade BRD4-knockdown signifikant Cd-ökade transkriptionsnivåer av inflammatoriska cytokiner i NRK-52E-celler (Fig. S1C). Sammantaget tyder dessa fynd på att BRD4 är en kritisk regulator av Cd-utlöst inflammatoriskt svar i råttnjurar.

3.3. BRD4-expressionsnivåer förblir oförändrade efter Cd-exponering

Därefter upptäcktes förändringar i uttrycksnivåerna för BRD4 efter Cd-exponering. NRK-52E-celler behandlades med Cd under en koncentrationsgradient och råttor injicerades intraperitonealt med Cd under 5 dagar för att klargöra effekten av Cd på BRD4-uttryck i njuren in vivo och in vitro. Resultaten visade att BRD4-proteinnivåerna var oförändrade i både de Cd-exponerade NRK-52E-cellerna (Fig. 3A-B) och råttnjurvävnader (Fig. 3C-D). Dessutom var BRD4-mRNA-nivåer oförändrade efter Cd-exponering (Fig. 3E-F). Dessa resultat indikerar att BRD4 förmedlar Cd-utlöst inflammatoriskt svar inte beror på förändringar i uttrycksnivå.

3.4. BRD4 reglerar Cd-främjad NF-KB nukleär translokation

Rollerna för BRD4 i Cd-utlöst inflammatoriskt svar undersöktes i vår studie. Förändring av NF-KB-signalvägen är nära relaterad till transkriptionen av inflammatoriska cytokiner (Chi et al., 2021). Vår studie fann att BRD4 är involverad i Cd-reglerad nukleär translokation och aktivering av NF-KB. Först bestämdes den subcellulära lokaliseringen av NF-KB genom IF-färgning och IHC-färgning. Data i Fig. 4A och D visade att JQ1 hämmar Cd-främjad NF-KB nukleär translokation i NRK-52E-celler och njurvävnader från rått. Under tiden visade Western blot-resultat att JQ1 signifikant minskade Cd-ökade nukleära proteinnivåer av NF-KB in vivo (Fig. 4B-C) och in vitro (Fig. 4E-F). På liknande sätt hämmade BRD4-knockdown också signifikant Cd-främjad NF-KB-kärntranslokation (Fig. S2A) och minskade Cd-ökade nukleära proteinnivåer av NF-KB (Fig. S2B-C) i NRK-52E-celler. Sammantaget kan hämning av BRD4 minska Cd-främjad NF-KB nukleär translokation, vilket tyder på att BRD4 förmedlar aktiveringen av NF-KB-signalvägen i njuren efter Cd-exponering.

3.5. Cd ökar RelA K310 acetyleringsnivåer

Studier har bekräftat att BRD4 binder till acetylerad RelA K310 genom sina bromdomäner för att reglera NF-KB-beroende transkription (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Således detekterades acetyleringsnivån av RelA K310 och uttrycket av två enzymer. Data visade att RelA-K310ac- och acetylas Ep300-proteinnivåerna minskade kontinuerligt med den ökade koncentrationen av Cd, medan deacetylas Sirt1-proteinnivån gradvis ökade i NRK-52E-celler (Fig. 5A-B) och råttnjurvävnad (Fig. 5A-B) 5C-D). Även Ep300 och Sirt1 mRNA nivåer visade samma trender (Fig. 5E-F). Dessa resultat tyder på att Cd främjar acetyleringsnivån av RelA K310, så BRD4 kan vara involverad i Cd-utlöst inflammatorisk cytokintranskription i njuren.

3.6. Cd ökar BRD4-bindningen till RelA-K310ac för att förbättra dess transkriptionsfunktion

Bindning till acetyleringsställen är grunden för transkriptionsregleringen av BRD4 (Huang et al., 2009). För att verifiera om Cd reglerar BRD4-funktionen genom att öka BRD4-bindningen till RelA-K310ac, upptäcktes interaktionen mellan RelA-K310ac och BRD4 via Co-IP. Data i Fig. 6A visade att Cd signifikant förbättrade interaktionen mellan RelA-K310ac och BRD4 i NRK-52E-celler, vilket lindrades av JQ1-behandling eller BRD4-nedbrytning. Samma trend observerades också i njurvävnader från rått (Fig. 6B). Dessa resultat visar att Cd förbättrar bindningen av BRD4 till RelA-K310ac, vilket främjar NF-KB-beroende transkription och därefter bidrar till det Cd-utlösta inflammatoriska svaret.

4. Diskussion

Cd har rapporterats som en potentiell utlösare av inflammation på grund av dess höga toxicitet, medan den exakta mekanismen fortfarande inte är helt klarlagd (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Vår studie bekräftade att Cd inducerar uttryck av inflammatoriska cytokiner i njurceller från råtta och fann att BRD4, ett epigenetiskt mål som har kritiska funktioner i en rad cellulära processer inklusive inflammation, bidrar till Cd-utlöst inflammatoriskt svar. Ytterligare experiment indikerade att BRD4 är involverad i Cd-främjad NF-KB-signalvägaktivering. Cd ökade också acetyleringsnivån av RelA K310, vilket ökade BRD4-bindningen till acetylerad NF-KB RelA för att främja NF-KB-beroende inflammatorisk cytokintranskription.

Inflammation är en av de naturliga försvarsmekanismerna mot exogena kemikalier, medan det okontrollerade och olämpliga inflammatoriska svaret kan skada normala vävnader och inducera autoimmuna sjukdomar (Jian et al., 2018). Cd-ökade biologiska markörer för inflammation var ofta associerade med olika sjukdomar. Studier har visat att Cd-inducerad inflammation är involverad i aterogenes (Tinkov et al., 2018). Dessutom främjade Cd uttrycket av inflammatoriska cytokiner, vilket bidrog till skador på lung- och testikelvävnad och inducerar hepatotoxicitet (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Dessa skadliga effekter överensstämmer med våra resultat, att det inflammatoriska svaret är involverat i Cd-inducerad njurskada. Ökande forskning har fokuserat på förekomstmekanismerna för Cd-inducerad inflammation. Som en välstuderad BET-proteinfamiljemedlem spelar BRD4 en avgörande roll i många biologiska processer inklusive inflammation. Här användes JQ1 (en hämmare av BRD4) och siRNA för att avreglera den funktionella aktiviteten av BRD4 och fann att hämningen av BRD4 minskade Cd-inducerad transkription av inflammatoriska cytokiner i råttnjurar, vilket tyder på att BRD4 deltar i det Cd-utlösta inflammatoriska svaret . Det anses allmänt att dysregleringen av BRD4-uttryck är en avgörande händelse i förekomsten av inflammatorisk respons. Vid ryggmärgsskada, patologisk hjärthypertrofi och andra inflammationsrelaterade sjukdomar bidrog det störda BRD4-uttrycket till uttrycket av inflammatoriska cytokiner (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Cd hade dock ingen effekt på expressionsnivåerna av BRD4 under de nuvarande experimentella förhållandena, vilket fick oss att överväga om BRD4 förmedlar det Cd-utlösta inflammatoriska svaret genom andra vägar.

NF-KB är en viktig regulatorisk faktor i inflammatoriska processer och är ansvarig för att kontrollera uttrycket av många inflammatoriska mediatorer (Lawrence, 2009). Studier har rapporterats att BRD4 är involverad i regleringen av NF-KB-signalvägen. Huang et al. (2017) föreslog att BRD4 reglerade IKK-medierad NF-KB-aktivering genom p38- och JNK-MAPK-vägarna. Wang et al. (2019a) fann att BRD4 knockdown eller JQ1-behandling blockerade lipopolysackarid (LPS)-aktiverad NF-KB-signalväg i mikroglia. Meng et al. (2014) visade att JQ1-behandling blockerade uttrycket av de inflammatoriska cytokinerna genom att hämma aktiveringen av NF-KB i LPS-behandlade RAW 264.7-celler. Dessa rapporter indikerade att BRD4 förmedlar aktiveringen av NF-KB i många inflammationsmodeller samtidigt som inhibering av BRD4 är ett effektivt terapeutiskt tillvägagångssätt för antiinflammation. I den aktuella studien blockerade hämningen av BRD4 den nukleära translokationen av NF-KB i Cd-exponerade råttnjurvävnader och NRK-52E-celler, vilket tyder på att BRD4 förmedlar den Cd-aktiverade NF-KB-signalvägen.

Typiskt, efter att NF-KB aktiverats av olika stimuli och translokerats in i kärnan, binder BRD4 till acetylerad NF-KB RelA vid K310-stället, vilket ökar dess stabilitet och transkriptionella aktivitet i kärnan (Hajmirza et al., 2018). Acetyleringsnivån hos RelA K310 påverkar således den reglerande funktionen av BRD4 på det inflammatoriska svaret. I hippocampala neuroner medierade deacetylaset Sirt1 RelA K310-deacetylering för att reglera BACE1-uttryck, vilket bidrog till produktionen av neuronal amyloid (Flores-Leon et al., 2019). I glioblastomceller nedreglerade fotodynamisk terapistress deacetylaset Sirt1 och aktiverade acetylaset Ep300, vilket ökade RelA-K310ac-nivåerna och ledde till förhöjd produktion av kväveoxiden för överlevnad (Fahey et al., 2019). Vår studie fann att Cd främjar acetyleringsnivån av RelA K310 genom att öka Ep300-uttrycket och minska Sirt1-uttrycket, vilket indikerar att Cd påverkar den reglerande funktionen BRD4 genom att öka acetyleringsnivåerna för RelA K310.

Speciellt visade våra resultat att JQ1-behandling var effektivare än BRD4-nedbrytning för att lindra Cd-utlöst inflammatoriskt svar. JQ1 har en hög bindningsaffinitet med BRD4 och kan nästan helt blockera BRD4-bindning till kromosomen, medan siBRD4 endast kan störa BRD4-proteinuttryck för att minska BRD4-bindning till målstället, vilket tyder på att BRD4 förmedlar Cd-utlöst inflammatoriskt svar kan bero på bindning med acetylerad NF-KB RelA. Nyligen genomförda studier har visat en liknande regleringsmekanism: efter NF-KB nukleär translokation och aktivering interagerade BRD4 sedan med acetylerad RelA för att samaktivera transkriptionsaktiveringen av NF-KB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 rekryterades till NF-KB-målpromotorer under olika inflammatoriska stimuleringsförhållanden, medan JQ1-behandling verkade genom att förhindra BRD4-bindning till acetylerad NF-KB RelA, vilket minskade transkriptionsaktiviteten av NF-KB (Zou et al., 2014). Våra resultat visade att hämningen av BRD4 blockerar Cd-förstärkt interaktion mellan BRD4 och RelA-K310ac i råttnjurar, vilket stöder våra ovanstående resultat att inhibering av BRD4 undertrycker den Cd-inducerade transkriptionsaktiviteten av NF-KB, vilket indikerar att Cd förbättrar BRD4-bindningen till acetylerad NF-KB RelA för att öka transkriptionen av inflammatoriska cytokiner.

Sammanfattningsvis avslöjade vår studie de reglerande mekanismerna för BRD4 i Cd-utlöst inflammatoriskt svar i råttnjurar: (1) BRD4 förmedlar Cd-inducerad NF-KB nukleär translokation och aktivering. (2) Cd ökar RelA K310-acetyleringsnivåerna och förbättrar BRD4-bindningen till acetylerad NF-KB RelA, vilket främjar NF-KB-beroende inflammatorisk cytokintranskription. Dessutom lindrade hämningen av BRD4 signifikant Cd-förhöjda inflammatoriska cytokinnivåer, vilket tyder på att riktad BRD4 har potential att utvecklas som ett effektivt sätt att behandla inflammatoriska sjukdomar inklusive Cd-inducerad nefrit.

CRediT författarskapsbidragsförklaring

Zhongguo Gong: konceptualisering, metodik, visualisering, formell analys, validering, undersökning, formell analys, datakurering, skrivande – originalutkast. Gang Liu: konceptualisering, metodik, visualisering, datakurering, skrivande – originalutkast, projektadministration, finansieringsförvärv. Wenjing Liu: Programvara, resurser, metodik, formell analys. Hui Zou: Projektadministration, Supervision. Ruilong Song: Programvara, formell analys, övervakning. Hongyan Zhao: Programvara, formell analys, övervakning. Yan Yuan: Övervakning. Jianhong Gu: Övervakning. Jianchun Bian: Finansieringsförvärv, övervakning. Jiaqiao Zhu: Skriva – recension och redigering, övervakning. Zongping Liu: Skriva – recension och redigering, övervakning,

Projektadministration, Finansieringsanskaffning, konceptualisering.

Förklaring av konkurrerande intresse

Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som kan ha tyckts påverka det arbete som redovisas i denna artikel.

Bekräftelse

Detta arbete stöddes av Kinas National Natural Science Foundation (nr 31872533, 31902329, 32072933), Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (nr 2016YFD0501208) och projektet för Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutionen (PADP). Manuskriptet redigerades för korrekt engelska språk, grammatik, skiljetecken, stavning och övergripande stil av en eller flera av de högkvalificerade engelsktalande redaktörerna på ELIXIGEN.

Referenser

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Kungsgelé dämpar kadmium-inducerad nefrotoxicitet hos möss av hankön. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Samexponering för icke-toxiska nivåer av kadmium och fluorid inducerar levertoxicitet hos råttor via utlöser mitokondriell oxidativ skada, apoptos och NF-kB-vägar. Environ. Sci. Förorena. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Bockhornsklöverfröpulver mildrar kadmium-inducerad testikelskada och levertoxicitet hos hanråttor. Exp. Toxicol. Patol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting på Nrf2: hur Nrf2-signalering kan påverka de terapeutiska aktiviteterna hos BET-proteinhämmare. Bioessays 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Roller av selenoprotein S i reaktiv syreart-beroende neutrofil extracellulär fälla inducerad av selen- bristfällig arterit. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J. ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 styr utvecklingen av hematopoetiska stamceller och modulerar makrofagernas inflammatoriska svar. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Född, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstr.m, G., 2017. Kadmiumexponering är associerad med löslig urokinasplasminogenaktivatorreceptor, en cirkulerande markör för inflammation och framtida hjärt-kärlsjukdom. Environ. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Uppströms signaleringshändelser leder till förhöjd produktion av pro-survival kväveoxid i fotodynamiskt utmanade glioblastomceller. Fri radikal. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Variation av olika metaboliter och tungmetaller i Oryza sativa L., relaterad till kronisk njursjukdom av okänd etiologi i Sri Lanka. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Palmitinsyra-inducerad NAD( plus ) utarmning är associerad med den minskade funktionen av SIRT1 och ökat uttryck av BACE1 i hippocampus neuroner. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Kadmiumbehandling inducerar echinococcos, DNA-skada, inflammation och apoptos i hjärtvävnad hos albino Wistar-råttor. Environ. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. inflammation och cancer. Biomediciner 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Akut exponering för kadmium inducerar förlängd neutrofili tillsammans med fördröjd induktion av granulocytkolonistimulerande faktor i lever på möss. Båge. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Effekterna av kadmiumexponering vid induktion av inflammation. Immunopharmacol. Immunotoxikol. 42 (1), 1–8.