Den serum/PDGF-beroende melanogena rollen för minutnivån av det onkogena kinaset PAK1 i melanomceller bevisat av den mycket känsliga kinasanalysen
Mar 18, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Sammanfattning:Vi har tidigare visat att det onkogena kinaset PAK4, som både melanom och normala melanocyter uttrycker på en mycket hög nivå, är avgörande för derasmelanogenes. I den föreliggande studien, med användning av den mycket känsliga "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) kinasanalysen, undersökte vi den melanogena potentialen hos ett annat onkogent kinas PAK1, som melanomceller (B16F10) uttrycker endast på en mycket liten nivå. Efter transfektering av melanomceller med PAK1-shRNA för att tysta PAK1-genen, melanininnehåll,tyrosinasaktivitet och kinasaktivitet hos PAK1 jämfördes mellan vildtyp och transfektanter. Vi fann att (i) PAK1 aktiveras signifikant av melanogena hormoner som IBMX (3-isobutyl-1-metylxantin) och -MSH (melanocytstimulerande hormon), (ii) tystar den endogena PAK1-genen i melanomceller genom PAK1-specifikt shRNA minskar både melanininnehåll ochtyrosinasaktivitet i närvaro av både serum och melanogena hormoner till basalnivån, (iii) den exogent tillsatta vildtyps-PAK1 i melanomcellerna ökar den -MSH-inducerbara melaninnivån flera gånger utan att påverka basalnivån, och (iv) - MSH/IBMX-inducerad melanogenes äger knappast rum i frånvaro av vare sig serum eller PAK1, vilket tydligt indikerar att PAK1 är väsentligt främst för serum- och -MSH/IBMX-beroendemelanogenes, men inte den basala, i melanomceller. Resultatet av denna studie kan utgöra den första vetenskapliga grunden för att förklara varför en mängd olika växtbaserade PAK1-blockerare som CAPE (koffeinsyrafenetylester), curcumin och shikonin i kosmetika är användbara förblekning av huden.
Nyckelord:PAK1,melanogenes, melanom,tyrosinas, MITF,blekning av hudenserum
blekning hudvård cistanche produkter
Introduktion
Färgen på hår, ögonbländare och hud styrs av en familj av pigment som kallas melaniner. Den intracellulära källan till melanin är tyrosin och omvandlas till melanin genom en serie enzymatisk oxidation (hydroxylering) som involverartyrosinas, TRP (tyrosinasrelaterat protein) 1 och TRP2. Uttrycket av gener som kodar för dessa melanogena enzymer kräver minst två onkogena/melanogena transkriptionsfaktorer (MTF): beta-catenin och MITF (mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor). Majoriteten av växtbaserade föreningar iblekning av hudenkosmetika antingen hämmar dessa melanogena enzymer direkt eller nedreglerar MTF:erna. Tyrosinanaloger som kojinsyra tillhör den första kategorin (tyrosinashämmare), medan majoriteten av resterna såsom CAPE (koffeinsyrafenetylester), curcumin och shikonin tillhör den andra kategorin (MTF-regulatorer) (1,2). Intressant nog är många av dessa MTF-regulatorer inklusive CAPE, curcumin, shikonin och cucurbitacin kända för att blockera det onkogena/åldrande kinaset PAK1 (RAC/CDC42-aktiverat kinas 1) (3-5). Således är det mest troligt att PAK1 är involverad i aktiveringen av dessa melanogena/onkogena transkriptionsfaktorer i hårceller, ögonirisar eller hudmelanocyter. Faktum är att åtminstone beta-catenin är bland de direkta substraten för PAK1 (6). PAK1 fosforylerar beta-catenin vid Ser 675 för aktiveringen, vilket leder till malign transformation. Dessutom är beta-catenin väsentligt för aktiveringen av MITF, vilket leder tillmelanogeneseller/och onkogenes av melanocyter (7).
Intressant nog avslöjades det dock nyligen att utslagningen av PAK1-genen i sig i pigmenterade möss inte lyckas producera några albinomöss (Hong He et al., opublicerad observation), vilket tydligt indikerar att åtminstone den basala melanogenesen i både hårceller och ögon iris är oberoende av PAK1, även om bidraget från PAK1 till hudenmelanogenesåterstår att klargöra.
Vi har tidigare visat att det onkogena kinaset PAK4 (CDC42-beroende kinas 4) är starkt uttryckt i både melanom och normala melanocytcellinjer och ansvarar för deras melanogenes, vilket aktiverar CREB/beta-catenin-MIFT-tyrosinasmedan PAK2 (RAC/CDC42-aktiverat kinas 2), en annan starkt uttryckt medlem av PAK-familjen, inte spelar någon roll i deras melanogenes (8).
I denna studie ger vi det första biokemiska beviset för en specifik roll för ett annat onkogent kinas som kallas PAK1 i hudenmelanogenes, trots det faktum att dess uttrycksnivå är liten: shRNA-inducerad tystnad av PAK1-genen i melanocyter (B16F10) härledda från musmelanom reducerade signifikant den -MSH/IBMX-inducerbaramelanogenestill den basala nivån, medan överuttryck av PAK1-genen ökade den -MSH-inducerbara melanogenesen utan att påverka den basala. Dessutom fann vi att den -MSH/IBMX-inducerbara melanogenesen kräver en serumfaktor som med största sannolikhet är PDGF (blodplättshärledd tillväxtfaktor). I det serumfria mediet, endast basaltmelanogenesäger rum.
cistancheminska aktiviteten av tyrosinas
2. Material och metoder
2.1. Material
B16F10 melanomceller köptes från American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). PAK1-SureSilencing-plasmider, attraktiv transfektion, endofree® plasmid maxi-kit köptes från Qiagen (Valencia, CA 91355, USA). Primära PAK1-antikroppar, biotinylerade sekundära antikroppar, signalfireTM ECL-reagens erhölls från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Kinase Glo-reagens och ATP (ATP_Glo-kinas-kit) köptes från Promega (Madison, Wisconsin, USA). Lipofectamine och JM109 kompetenta celler köptes från Invitrogen och Life Technology. AG1295 och AG1478 köptes från Calbiochem (San Diego, CA, USA). Alla andra kemikalier inklusive human PDGF-bb köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
2.2. Tystnad av PAK1-genen i musmelanocyter (B16F10) genom stabil transfektion med mus PAK1-specifikt shRNA
2.2.1. Cell kultur
B16F10 melanomceller odlades i DMEM kompletterat med 10 procent värmeaktiverad FBS och 1 procent penicillin/streptomycin (10,000 U/mL och 100 µg/ml) vid 37 grader i en fuktad atmosfär innehållande 5 procent CO2.
2.2.2. Stabil transfektion med mus PAK1-specifikt shRNA
ShRNA-transfektion av B16F10-cellinje utfördes i princip genom samma procedur som tidigare beskrivits (9), men med mus PAK1-specifika shRNA (# KM04553, Qiagen). Följande fyra distinkta kloner av shRNA:er användes för transfektionen: klon 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), klon 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), klon 3 (GTACACACGGGTTCGAGAAGAT) och klon 4 (GTACCACCAGGTGTCAGAAGAT) såväl som den negativa kontrollen (WATT-kontroll) . I denna studie visade sig emellertid klonerna 1 och 2 vara mer effektiva än klonerna 3 och 4 för att tysta mus-PAK1-genen i denna melanocytlinje (data visas ej). Stabila transfektanter selekterades i närvaro av G418 (1 mg/ml) som dödar mer än 99 procent av icke-transfekterade celler.
2.2.3. Western-blot-analys av PAK1-proteinnivå och in vitro-analys för kinasaktiviteten av PAK1 i transfektanter
2.2.3.1. Western blot-analys
För att kvantifiera den extremt låga nivån av PAK1 i både kontroll (WT) cellinje och PAK1-tysta transfektanter (G418-resistenta), genom att minimera de "icke-specifika brus"-nivåerna, genomförde vi den västra blot-analys med användning av en polyklonal kaninantikropp mot PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) som den primära antikroppen. I korthet såddes varje klon i en koncentration av 2 x 105 celler/brunn i en platta med 6 brunnar, förodlades i 48 timmar, och cellysaten kokades i 25 µL SDS-PAGE-buffert under 5 minuter. Åtta µl (innehållande 15 µg totalt protein) av varje supernatant per lucka användes för SDS-PAGE. Nitrocellulosan blottades med anti-PAK1 IgG (1:1,000 utspädning som en primär antikropp), och som sekundära antikroppar, HRP-länkade anti-kanin IgG och anti-biotin IgG (#7074, # 7075, Cell Signaling) användes för att detektera både PAK1- och -aktinband som så småningom visualiserades med ECL-systemet från Amersham. Western blot-analyserna var representativa för tre oberoende experiment.
2.2.3.2. "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo) kinasanalys för PAK1 i melanomceller
Kinasaktiviteten hos PAK1 i WT-melanocyterna och shRNA-transfektanter (SH) mättes genom en betydande modifiering (5) av en decennium gammal metod (som vi myntade "Macaroni-Western") utvecklad av en italiensk grupp (1{{39 }}). Kortfattat förodlades B16F10 melanomcellinjer (WT eller SHs, 2 × 105 celler/ml) på 6-brunnsplatta i 24 timmar. Sedan behandlades celler med 100 nM -MSH eller 100 µM IBMX under 48 timmar. Celler sönderdelades av lysbuffert innehållande 50 mM Tris HCl pH 7,5 och 150 mM NaCl och 1 procent Triton-X. För immunoutfällning (IP) av PAK1 inkuberades de rensade cellysaten med anti-PAK1 IgG (1:50 utspädning) och protein A-agarospärlor under 1-2 timmar i kylrummet med kontinuerlig skakning med en roterande mixer (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Japan). Den resulterande IP (PAK1) från varje lysat inkuberades med ATP Glo kinas assay kit (Promega) i närvaro av ATP och MBP (myelin basiskt protein) under 1 timme vid 37 grader, och den återstående ATP nivån mättes med ATP- beroende Luciferin-Luciferas-reaktion som så småningom genererar en luminescens (10). Den slutliga suspensionen centrifugerades och supernatanten överfördes till en 96-brunnsplatta för avläsning. Luminescens registrerades av MTP-880Lab-mikroplattläsare (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan) med en integrationstid på 0,5 s per brunn.
2.3. Mätning av melaninhalt och tyrosinasaktivitet i transfektanter
2.3.1. Mätning av melaninhalt
Melaninhalten bestämdes som tidigare beskrivits (11). I korthet ströks B16F10-celler (vildtyp eller PAK1-specifika shRNA-transfektanter) ut med en densitet av 2 × 104 celler/brunn i en 24-brunnsplatta. Efter 24 timmars odling tillsattes 100 µM isobutyl-1-metylxantin (IBMX) eller 100 nM -MSH och inkuberades i ytterligare 72 timmar vid 37 grader. Cellerna tvättades två gånger med fosfatbuffert, lyserades sedan med 500 µL av en lösning innehållande 1 M NaOH och 10 procent DMSO och inkuberades vid 80 grader i 1 timme för att solubilisera melaninet, och melaninhalten mättes vid 490 nm. För att jämföra melaninhalten i vildtyps- och transfekterade celler ansågs den totala mängden melanin som producerades av vildtypsmelanocyterna som kontroll (100 procent), och de av transfektanterna beräknades i enlighet därmed.
2.3.2. Analys för intracellulär tyrosinasaktivitet
Tyrosinasaktiviteten bestämdes som tidigare beskrivits (12), med en lätt modifiering. B16F10-celler (vildtyp eller transfektanter) ströks ut med en densitet av 2 × 104 celler/brunn, och efter 24 timmars odling tillsattes 100 µM IBMX eller 100 nM -MSH och inkuberades i ytterligare 72 timmar vid 37 grader . Cellerna tvättades sedan med iskall fosfatbuffert och lyserades med fosfatbuffert (pH 6,8) innehållande 1 procent Triton-X (500 µL/brunn). Plattorna frystes vid -80 grader i 30 min. Efter upptining tillsattes 100 µL av 1 procent L-DOPA till varje brunn. Efter inkubation vid 37 grader under 2 timmar, mättes absorbansen vid 490 nm.
2.4. Mätning av melaninhalten i vildtyps- och PAK-1-överuttryckande melanocyter efter -MSH-behandling
Med användning av Myc-vektor (2 µg) transfekterades melanocyter (B16F10) övergående med antingen vildtyp (WT) PAK1 eller så kallad "konstitutivt aktiverad" (CA) PAK1 bärande T423E-mutation. Efter 3 dagars odling skördades varje transfekterad klon för ytterligare experiment. Effekten av PAK1-överuttryck på melaninhalten mättes genom samma procedurer som beskrivits tidigare (8). Kortfattat inkuberades melanocyter, antingen vildtyps- eller PAK-1--överuttrycket som uttrycker antingen vildtyp-PAK1 eller dess CA-mutant, med 100 nM -MSH under 3 dagar. Celler lyserades med en lösning innehållande 1 M NaOH och 20 procent DMSO för att lösa upp melaninet, och dess innehåll bestämdes vid 405 nm.
2.5. Melanogenes i ett serumfritt medium
B16F10-celler (vildtyps- eller PAK1-specifika shRNA-transfektanter) ströks ut med en densitet av 2 × 104 celler/brunn i en 24-brunnsplatta i närvaro av 10 procent FBS. Efter 24 timmars inkubation ersätts odlingsmediet med ett serumfritt medium och odlas i ytterligare 72 timmar med eller utan 100 µM IBMX eller 100 nM -MSH för att mäta melaninhalten.
2.6. Effekt av PDGF/EGF-receptorhämmare på serumberoende melanogenes
2 × 104 B16F10-celler såddes i varje brunn under 24 timmar i 10 procent FBS-innehållande medium och odlades sedan under ytterligare 72 timmar i det färska mediet innehållande 100 nM -MSH och följande: (1) inget serum, (2) 10 procent enbart FBS, (3) 10 procent FBS plus 2 µM AG1295 (PDGF-receptorinhibitor) och (4) 10 procent FBS plus 400 nM AG1478 (EGF-receptorinhibitor), för att mäta melaninhalten.
2.7. Statistisk analys
Data uttrycks som medelvärden med deras standardfel. Statistiska jämförelser utfördes med envägs ANOVA följt av Duncans multipelområdestest. Statistisk analys utfördes med SAS (release 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA), och p Mindre än eller lika med 0.05 ansågs signifikant.
maca ginseng cistanche
3. Resultat
3.1. Aktivering av PAK1 i en melanomcellinje (B16F10) av melanogena hormoner
Två melanogena hormoner, -MSH (melanocytstimulerande hormon) och IBMX (3-isobutyl-1-metylxantin) används ofta för att stimuleramelanogenesi melanocyter såsom melanomcellinje B16F10. Därför undersökte vi först om dessa hormoner kan aktivera PAK1 i denna cellinje, även om proteinnivån för PAK1 där är extremt låg jämfört med PAK2 och PAK4 (8). För att övervaka förändringarna i kinasaktivitet av PAK1 i celler utvecklade vi nyligen en mycket känslig/specifik kinasanalys som kallas "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) kinasanalysprotokoll genom att kombinera immunutfällningen (IP) av PAK1 från cell lysater och Promegas ATP_Glo kinase kit (5). Genom att använda denna kinasanalys fann vi att både -MSH (100 nM) och IBMX (100 µM) aktiverar PAK1 i melanomceller, med -MSH som är mer potent än IBMX (se i figur 1). Vi bör dock påminna läsarna om att veckaktiveringen av PAK1 som visas här endast är uppenbar, eftersom under denna tidskrävande provrörs-IP och kinasanalys (över 3 timmar totalt) som äger rum utan dessa melanogena hormoner, skulle PAK1 gradvis normaliseras över tid. Med andra ord kan vi inte frysa den exakta kinasstatusen för PAK1 i slutet av cellodling som behandlats med dessa stimulatorer, och veckaktiveringen är bara en underskattad reflektion av PAK1-aktivering som ägde rum under cellodling av dessa simulatorer.
3.2. Tysta av PAK1-genen av shRNAs i musmelanomcellinje
För att ytterligare undersöka biokemiskt om PAK1 bidrar tillmelanogenesi hudceller (melanocyter) transfekterade vi stabilt melanomcellinjen B16F10 med mus PAK1-specifikt shRNA för att tysta PAK1-genen selektivt.
3.2.1. Tysta PAK1-genen i melanocyter
Vår preliminära western blot-analys antydde att i två distinkta PAK1-tystade kloner (SH1 och 2) är PAK1-proteinnivåerna signifikant (med cirka 75 procent) reducerade, men tillväxthastigheten för denna melanomcellinje i sig var inte påverkas avsevärt av PAK1-dämpningen (data visas inte). Den exakta kvantifieringen av PAK1-proteinnivåer genom att skanna denna westernblot var dock ganska svår, främst på grund av det höga bakgrundsbruset runt PAK1-bandet i försöket att visualisera dess extremt låga uttrycksnivåer. Istället, med hjälp av "Macaroni-Western" kinasanalysen (5,10), verifierade vi att kinasaktiviteten för PAK1 i både SH1- och 2-kloner bara är cirka 25-30 procent av den i kontrollcellerna (WT) ( se figur 2A).
3.2.2. Minskning av melanogenesen genom att tysta PAK1-genen
Vår nästa kritiska fråga var om en sådan minskning av kinasaktiviteten hos PAK1 påverkarmelanogenes. Således jämfördes melanininnehållet i dessa kloner (SH1 och 2) med vildtyps (WT) melanomceller, efter att ha behandlat alla dessa celler med -MSH, en melanogen inducerare, i 72 timmar. Som visas i figur 2B reduceras melanininnehållet i dessa PAK1--bristiga melanocyter (SH1 och 2) med cirka 50 procent (51-55 procent), och når basalnivån i WT utan melanogent hormon. För att se om denna minskning av melaninhalten är associerad med undertryckandet av tyrosinasaktivitet, mätte vityrosinasaktivitet i PAK1-bristceller (klonerna SH1 och 2), jämfört med WT. Som visas i figur 2C är tyrosinasaktiviteten i PAK1--bristceller endast cirka 45 procent (33-58 procent) av den i WT, och når återigen den basala (icke-stimulerade) nivån, vilket tydligt indikerar att PAK1 är väsentligt för -MSH-inducerad melaninproduktion avtyrosinasi melanocyter. På ett mycket liknande sätt reducerades dessutom den IBMX-inducerade melanogenesen genom att tysta PAK1-genen i denna melanomcellinje (data visas inte). Men med hänsyn till följande två faktorer är det mest troligt att endast hälften avmelanogenesi melanocyter är PAK1-beroende, och det återstående (till stor del "basic") är PAK4-beroende: (i) PAK4 är också väsentligt för den -MSH-inducerade melanogenesen i melanocyter (8), och (ii) cirka 25 procent av PAK1-genen verkar fortfarande uttryckas i dessa transfektanter (SH1 och 2). Det återstår dock att tydligt klargöra om PAK1 är ansvarig för det hormoninducerbara eller basalamelanogenes.
Vidare har vi bekräftat att den endogena PAK1 är signifikant aktiverad av melanogena inducerare som IBMX och -MSH i denna melanomcellinje (se figur 1), men utan någon signifikant förändring i dess autofosforylering vid Thr 423 enligt bedömningen av anti-pPAK1 antikropp (data visas ej).
3.3. Ökning av -MSH-inducerbar melanogenes genom överuttryckt PAK1
Genom överuttryck av vildtyp (WT) PAK1-genen i melanocyter (B16F10-cellinje) genom transfektion, avslöjade vi att den exogent tillsatta PAK1-genen ökar den -MSH-inducerbara melaninnivån med flera veck (se till vänster i figur 3, jämför spår 2 och 4), medan det knappast påverkar den oberoende "basala" melaninnivån i sig (jämför spår 1 och 3 i den vänstra panelen i figur 3), vilket tyder på att PAK1 huvudsakligen bidrar till -MSH/IBMX-beroendemelanogenes, och inte den basala melanogenesen utan exogen(a) stimulator(er).
3.4. Serumeffekt på -MSH/IBMX-inducerbar melanogenes
Mer intressant, fann vi att induktionen av melanogenes av -MSH/IBMX kräver 10 procent FBS (fetalt bovint serum) förutom PAK1. Som visas i figur 4A, i ett serumfritt medium, inducerade varken -MSH eller IBMX knappastmelanogenesi WT-cellerna, även om endast 10 procent FBS (utan -MSH/IBMX) inducerademelanogenesbetydligt (med cirka 60 procent). Intressant nog var melanogenesen i SH-transfektanter (PAK1-bristceller) i närvaro eller frånvaro av serum samma nivå som i WT-celler i frånvaro av serum (se figur 4B), vilket tyder på att den serumberoende melanogenesen kräver också PAK1. För att stödja denna uppfattning aktiverar enbart serum signifikant kinasaktiviteten hos PAK1 i WT-celler, men den -MSH-beroende aktiveringen av PAK1 i WT-celler kräver serum (se figur 4C).
När det gäller den kemiska naturen hos melanogen serumfaktor som ensam aktiverar PAK1, spekulerar vi att det är PDGF (trombocythärledd tillväxtfaktor) av följande skäl: (i) för mer än ett decennium sedan har vi visat att PDGF är den enda tillväxtfaktorn i serum som aktiverar PAK1 genom transaktivering av EGF-receptorn (epidermal tillväxtfaktor) med PDGF-receptorn (13,14), och helt nyligen har andra visat att antingen PDGF eller EGF ensamt faktiskt stimulerarmelanogenesav melanocyter (15,16).
3.5. Den serum/PDGF-beroende melanogenesen kräver EGF-receptor
I ett försök att identifiera den specifika kemiska naturen hos denna melanogena serumfaktor, har vi testat effekten av antingen AG1295 (hämmare specifik för PDGF-receptor) eller AG1478 (hämmare specifik för EGF-receptor) på den serumberoendemelanogenesi melanocyter. Som visas i figur 5 reducerade antingen 2 µM AG1295 eller 400 nM AG1478 kraftigt det serumberoendemelanogenestill den nivå som motsvarar den grundläggande (serumfria) melanogenesen. Eftersom PDGF är rikligt närvarande i serum, men inte EGF och AG1295 inte hämmar EGF-receptorn, medan AG1478 inte hämmar PDGF-receptorn (13), är det mest troligt att PDGF i serum aktiverar sin receptor som i sin tur transaktiverar EGF-receptorn som aktiverar så småningom PAK1 som är väsentligt för serumberoende melanogenes (för detaljer, se figur 6). Baserat på detta antagande kommer vi senare att diskutera den mest troliga mekanismen som ligger till grund för den uppenbara synergin mellan -MSH och serum/PDGF för aktivering av PAK1, vilket leder till robust melanogenes.
Slutligen bör det vara värt att påpeka att det "basala" melanininnehållet utan -MSH inte förändrades signifikant av överuttryckt CA (konstitutivt aktiv) mutant av PAK1 som bär T423E-mutation (se den vänstra panelen i figur 3, bana 5) som om det var antingen en DN (dominant negativ) eller inaktiv mutant. Faktum är att -MSH inte inducerade fosforyleringen av WT PAK1 vid Thr 423 alls (data visas inte). Således kan man dra slutsatsen att autofosforyleringen av PAK1 vid Thr 423 inte har något att göra med -MSH-inducerad aktivering av PAK1, vilket leder till den robustamelanogenesi melanomceller. Eftersom T423E-mutant av PAK1 är välkänd för att vara mycket onkogen (6), kanske autofosforyleringen vid Thr 423 kan tjäna en omställning från "melanogen" till "onkogen" signalering.
4. Diskussion
Från vår observation av både PAK1-beroende och PAK4-beroende melanogenes i melanocyt-/melanomceller, framkommer två potentiellt intressanta frågor att påpeka: (i) Den "specifika" melanogena aktiviteten hos PAK1 ( endast minut uttryckt) måste vara mycket högre än PAK4 (högt uttryckt) i melanomceller. (ii) Det verkar som att PAK1 är huvudsakligen ansvarig för seruminducerad melanogenes, medan PAK4 huvudsakligen är ansvarig för det inre (basala)melanogenes. Med andra ord, även om PAK4-brist är embryonalt dödlig hos möss, medan PAK1-brist ensam misslyckas med att producera "albino" möss, är den uppenbara skillnaden i den ursprungliga hudfärgen (grundläggande)melanogenes) mellan svarta och vita människor till exempel kan åtminstone delvis vara en återspegling av skillnaden i uttrycksnivån för PAK4, såväl som skillnaden i nivån av melanogentyrosinass.
In vivo, med hjälp av HRM-2 (pigmenterade men hårlösa) möss, har vi nyligen visat att en kräm som innehåller 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-hämmare) minskar den UV-inducerade melanogenesen i huden till basal nivå, även om det fortfarande återstår att klargöra om PAK4 eller PAK1 är ansvarig för UV-induktion av melanogenes (8). Eftersom PAK1 är ansvarig för den inducerbara, men inte den basala, melanogenesen, skulle det vara värt att testa om PAK1 signifikant bidrar till den UV-inducerbaramelanogenes(solbränna) också, med användning av den sällsynta PAK1 KO (knock out) mutanten som härrör från C57B16-stam av möss som bär mörka hår och ögon (Hong He et al., opublicerad observation), i ett försök att förstå om en mängd olika växtbaserade PAK1 blockerare i kosmetika är användbara för solskyddsmedel eller inte. Intressant nog rapporterades PAK1 aktiveras av UV-bestrålning och andra DNA-skadande medel (17).
Det har visats att -MSH aktiverar Tyr-kinaset JAK2 (18), vilket i sin tur aktiverar PAK1 genom fosforyleringen vid Tyr 285 (istället för Thr 423), vilket leder till PIX-PAK1-interaktionen (19). Detta kan förklara varför varken -MSH-beroende aktivering av PAK1 eller melanogenes involverar autofosforylering av PAK1 vid Thr 423. Därför undersökte vi nyligen om den PAK1-beroende melanogenesen blockeras av en potent växtbaserad JAK2- hämmare som kallas cucurbitacin I (CBI) från bitter melon (Goya) som direkt hämmar JAK2 (20), och fann att CBI hämmarmelanogenesi närvaro av melanogena hormoner med mer än 70 procent, vilket tyder på möjligheten att CBI blockerar inte bara PAK1 utan även PAK4 (5). I detta sammanhang skulle det vara av stort intresse att notera att de örtbaserade PAK1--blockerarna som CAPE, curcumin, shikonin och FTY 720 skulle kunna hämma den -MSH-inducerade melanogenesen i mus- eller mänskliga hudceller endast med ca. 50 procent även vid koncentrationer där PAK1 är nästan helt blockerad (1,2), medan den syntetiska pan-PAK-blockeraren PF3758309, som hämmar både PAK1 och PAK4, tar bortmelanogenesi hudceller med cirka 90 procent vid 300 nM (8). Med andra ord kunde det -MSH-inducerade melanogena systemet i melanocyter skilja de PAK1-specifika blockerarna från pan PAK-blockerarna. Hittills har inga örtbaserade PAK4-specifika blockerare (förutom PAK4-specifika siRNA) identifierats. En mycket potent kvassinoid som kallas glaukarubinon som härrör från ett bittert träd som odlats i Amazonas djungler har nyligen visat sig blockera både PAK1 och PAK4, vilket hämmar tillväxten av cancerceller i bukspottkörteln både in vitro och in vivo (21). Därför skulle det vara av stort intresse att testa om denna växtbaserade PAK-blockerare undertrycker melanogenesen av hudceller nästan helt, precis som PF3758309.
Huvudsyftet med denna studie var att fokusera på den specifika melanogena rollen av PAK1, och inte att undersöka i detalj hur PAK1 aktiverar den melanogena signalvägen inklusive melanogena enzymer och MTF: er. Det är dock mest troligt att PAK1 direkt aktiverar beta-catenin genom att fosforylera vid Ser 675, vilket leder till aktivering av MITF som är väsentligt för uttryck av gener som kodar för melanogena enzymer som t.ex.tyrosinas(Tyr).
Nyligen fann vi att PAK4 (CDC42-beroende kinas 4) också är involverad imelanogenesav samma melanomcellinje genom att aktivera två transkriptionsfaktorer, CREB och beta-catenin, som båda är väsentliga för MIFT-aktivering (8). Eftersom CREB är känt för att aktiveras av LIM-kinas (22,23) som liksom beta-catenin är bland de vanliga direkta substraten för både PAK1 och PAK4 (6,18), är det mest troligt att PAK1 och PAK4 delar samma CREB /beta-catenin-MITF signalvägar för att aktivera de melanogena enzymgenerna.
De detaljerade signalvägarna som leder till den -MSH/IBMX-beroende aktiveringen av PAK1 kan dock skilja sig betydligt från de som leder till aktiveringen av PAK4, främst på grund av att den förra involverar serumfaktorn (PDGF). Enbart serumet kan aktivera PAK1 (13) och förstärker den -MSH/IBMX-beroende aktiveringen av PAK1 också. Det finns med andra ord en tydlig synergi mellan serumet och dessa melanogena hormoner i både PAK1-aktivering ochmelanogenes.
Följande är vår arbetshypotes om hur denna synergi skulle kunna ske. Den huvudsakliga signalvägen som leder till PAK1-aktiveringen är den onkogena EGFR (epidermal tillväxtfaktorreceptor)-RAS-PI 3 kinas-RAC/CDC42-PAK1-kaskaden. Denna kaskad ensam är dock inte tillräcklig för full aktivering. Det behöver en annan faktor som kallas PIX, ett SH3-adapterprotein som binder PAK1 direkt genom sitt Pro-rika motiv av 18 aminosyror som kallas PAK18. PIX-PAK1-interaktionen behöver ett tredje protein som heter JAK2, ett Tyr-kinas, som fosforylerar PAK1 vid Tyr 285. RAS uppreglerar JAK2 genom prolaktin. Enligt några tidigare fynd av oss och andra (13-16) är PDGF (trombocythärledd tillväxtfaktor) den/de viktigaste melanogena serumfaktorerna som är väsentliga för den -MSH/IBMX-inducerademelanogenes, eftersom det aktiverar sin receptor (PDGFR) Tyr-kinas som i sin tur transaktiverar EGFR (epidermal tillväxtfaktorreceptor=ErbB1) Tyr-kinas, vilket leder till aktivering av PAK1 genom det onkogena RAS-PI3 kinaset-RAC /CDC42-väg (13). Således kan PDGF i enbart serum aktivera PAK1 och inducera melanogenes upp till halvvägs. För fullständig aktivering av PAK1-beroende melanogenes behövs dock -MSH/IBMX för att aktivera JAK2 genom en cAMP-beroende väg (som kan involvera PKA) som så småningom säkerställer PIX-PAK1-interaktionen (för detaljer, se figur 6).
Sammanfattningsvis presenterar vi här de allra första biokemiska bevisen som kan förklara hur en mängd växtbaserade PAK1-blockerare som CAPE, curcumin och shikonin i kosmetiska krämer kan bidra till "blekning av huden" effekter. En serie analoga studier med humana melanocyter väntas för ytterligare bevis eller bekräftelse.
maca ginseng cistanche
Referenser
1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Curcumin undertrycker alfa-melanocytstimulerande hormonstimulerad melanogenes i B16F10-celler. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.
2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Koffeinsyrafenetylester hämmar alfa-melanocytstimulerande hormoninducerad melaninsyntes genom att undertrycka transaktiveringsaktiviteten av mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.
3. Maruta H. Örtläkemedel som blockerar det onkogena kinaset PAK1: Ett praktiskt tillvägagångssätt mot PAK1-beroende sjukdomar och livslängd. Phytother Res. 2014; 28:656-672.
4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Flera växtbaserade föreningar i Okinawa-växter hämmar direkt det onkogena/åldrande kinaset PAK1. Drug Discov Ther. 2014; 8:238-244.
5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Kombination av immunoprecipitation (IP)-ATP_Glokinasanalys och melanogenes för bedömning av potenta och säkra PAK1-blockerare i cellkultur . Drug Discov Ther. 2015; 9:289-295.
6. He H, Maruta H. Onkogenicitet av PAK och deras substrat. I: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-activated kinases: Towards the cure of cancers and other PAK-beroende sjukdomar (Maruta H, red.). Elsevier, Oxford, 2013; s. 23-51.
7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Catenin-inducerad melanomtillväxt kräver nedströmsmålet mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.
8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-aktiverat kinas 4 reglerar kritiskt melanogenes via aktivering av CREB/MITF- och -catenin/MITF-vägarna. J Invest Dermatol. 2015; 135:1385-1394.
9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-aktiverat kinas 1 stimulerar tjocktarmscancercelltillväxt och migration/invasion via ERK- och AKT-beroende vägar. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803:1106-1113.
10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Användning av luminescerande teknologi för att utveckla en kinasanalys: Cdk4 som modellsystem. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Hämmande effekt av florotanniner isolerade från Ecklonia cava på svamptyrosinasaktivitet och melaninbildning i B16F10-melanomceller från mus. J Agric Food Chem. 2009; 57:4124-4129.
12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein hämmar melanogenes genom aktivering av ERK-signalvägen. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.
13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Blodplättshärledd tillväxtfaktor kräver epidermal tillväxtfaktorreceptor för att aktivera p21-aktiverade kinasfamiljenkinaser. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.
14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Receptorheterodimerisering: väsentlig mekanism för blodplättshärledd tillväxtfaktorinducerad epidermal tillväxtfaktorreceptortransaktivering. Mol Cell Biol. 2001; 21:6387-6394.
15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Blodplättshärledd tillväxtfaktor reglerar proliferation och differentiering av humana melanocyter på ett differentieringsstadiespecifikt sätt. J Dermatol Sci. 2016; 83:200-209.
16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Epidermal tillväxtfaktor (EGF) främjar in vitro-differentieringen av neurala crestceller till neuroner och melanocyter. Cell Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.
17. Roig J, Traugh JA. p21-aktiverat proteinkinas gamma PAK aktiveras av joniserande strålning och andra DNA-skadande medel. Likheter och skillnader med alfa PAK. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.
18. Buggy JJ. Bindningen av det alfa-melanocytstimulerande hormonet till dess G-proteinkopplade receptor på B-lymfocyter aktiverar Jak/STAT-vägen. Biochem J. 1998; 331:211-216.
19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Fosforylering av tyrosin 285 av PAK1 underlättar PIX/GIT1-bindning och vidhäftningsomsättning. FASEB J. 2015; 29:943-959.
20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Upptäckten av JSI-124 (cucurbitacin I), en selektiv Janus-kinas/signalomvandlare och aktivator av transkription 3 signalvägshämmare med potent antitumöraktivitet mot humana och murina cancerceller hos möss. Cancer Res. 2003; 63:1270-1279.
21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinone och gemcitabin minskar synergistiskt pankreascancertillväxt via nedreglering av p21-aktiverade kinaser. Cancer Lett. 2014; 346:264-272.
22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Cytoskelettförändringar som regleras av PAK4-serin/treoninkinaset förmedlas av LIM-kinas 1 och cofilin. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.
23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM-kinas 1 aktiverar cAMP-responsivt elementbindande protein under neuronal differentiering av immortaliserade hippocampala stamfaderceller. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.