Totala glykosider av Cistanche Deserticola främjar neurologisk funktionsåterställning genom att inducera neurovaskulär regenerering via Nrf- 2/Keap-1-väg i MCAO/R-råttor-Ⅱ

TGs främjar neural ombyggnad hos I/R-skadade råttor

Enligt många studier kan neurogenes efter en stroke avsevärt förbättra funktionell återhämtning. Synaptophysin (SYN), postsynaptic density 95 (PSD-95)-proteiner och mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP-2) användes som markörer för att undersöka neuronal plasticitet i den ischemiska penumbraen i cortex. För att bedöma effekterna av TG-, PS- och OS-behandling på neurogenes i I/R-skadade råttor, utfördes immunfluorescens och western blot för SYN-, PSD95- och MAP-2-uttryck. Som visas i figurerna 9 och 10 minskade uttrycksnivåerna för SYN, PSD95 och MAP-2 i I/R-råttor efter 14 dagars reperfusion i jämförelse med NOR-råttorna, medan TG:er och PS:er kunde avsevärt öka reglera deras uttrycksnivåer. OSs-gruppen hade ingen signifikant förändring jämfört med MOD-gruppen. Data indikerade att TGs och PSs botade dramatisktfrämja neural ombyggnad efter I/R-skada. 

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT SKYDDA MOT ISKEMISKA STROKE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TGs Alter Nrf-2 och behåller-1 uttryck hos I/R-skadade råttor

Oxidativ stress är den huvudsakliga patogena mekanismen vid I/R-skada. Studierna verifierade att Nrf-2 är en mästare som reglerar antioxidativa svar. För att undersöka Nrf-2 och Keap-1-medierade oxidativa svar efter I/R-skada, utvärderade vi cytoplasma

uttryck samt nukleär translokation av Keap-1. Under tiden analyserades också uttrycket av Nrf-2 i I/R-skadade råttors hjärnvävnader (figur 10 och 11). Enligt immunfluorescensanalysen visade sig Nrf-2 huvudsakligen vara lokaliserat i cytoplasman i NOR-gruppen. I TGs-gruppen var expressionen av Nrf-2 i cytoplasmatisk lokalisering nedreglerad, men uppreglerad i kärnan, och ett minskat Keap-1-uttryck observerades också. Data visade att hjärnskyddet för TGs kunde associeras med moduleringen av Nrf-2 och Keap-1.

TG:er dämpar oxidativ stress i hjärnvävnaden hos I/R-skadade råttor

För att bekräfta de antioxidativa effekterna av TGs utvärderades aktiviteterna hos SOD, CAT, GSH-Px och MDA i I/R-skadade råttor. I figur 12 ökade innehållet av MDA markant i MOD-gruppen, och samtidigt minskade aktiviteterna för SOD, CAT och GSH-Px, jämfört med de normala råttorna. Omvänt ledde TGs-behandling till en signifikant minskning av innehållet av MDA och en ökning av aktiviteterna för SOD, CAT och GSH-Px. Dessa resultat bekräftade ytterligare antioxidationsaktiviteten hos TG.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR BEHANDLING AV ISKEMISKA STROKE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

DISKUSSION

Många studier tyder på att TCM C. deserticola har omfattande biologiska aktiviteter, t.ex. förbättrad förmåga att lära, minne och immunitet. De aktiva komponenterna av C. deserticola för neuroskydd är dock fortfarande oklara. Det aktuella arbetet syftar till att screena de aktiva komponenterna frånC. deserticola mot ischemisk strokepå MCAO/R-modellen. Tre extrakt från C. deserticola (TGs, PSs och OSs) användes för att utvärdera deras effekter på MCAO/R-råttor, såväl som möjliga mekanismer.

Stroke är en vanlig akut cerebrovaskulär sjukdom. Epidemiologiska studier visar att stroke är vanligare hos män än hos kvinnor. Sålunda, i vårt experiment, antogs hanråttor för testerna. Våra resultat visade att I/R-induktion accelererade oxidativ stress och infarktvolym, bröt BBB och ledde till nerv- och cerebrovaskulär skada. Efter screening visade sig TG minska infarktvolymen och främja neural ombyggnad och angiogenes. Dessutom observerades TG bibehålla BBB-integritet efter I/R-skada. Tvärtom ger PS:er och OS:er ingen betydande lindring av I/R-skada. Således anses TGs vara den huvudsakliga aktiva fraktionen av C. deserticola för neuroskydd, potentiellt genom att främja neural ombyggnad, angiogenes och BBB-integritet genom att aktivera Nrf- 2/Keap-1-vägen.

Allt fler bevis tyder på att upprättandet av en effektiv kollateral cirkulation är signifikant viktig för att undvika bildandet av infarkt och ischemisk penumbra, och är en kritisk behandling i ett tidigt skede av ischemisk stroke. Proliferationen av vaskulära endotelceller och glatta muskelceller efter ischemisk infarkt bestämmer etableringen av kollateral cirkulation. Emellertid har ischemimodellerna ett vanligt fenomen, det vill säga oxidativ stress finns i stor utsträckning i hjärnans mikrovaskulatur. Studiedata har visat att ett stort antal antioxidanter kan störa funktionen hos BBB och egenskaperna hos angiogenes. CD31 och a-SMA är markörerna för vaskulära endotelceller respektive glatta muskelceller. För att undersöka effekten av den ovan nämnda cellproliferationen av extrakten från C. deserticola undersökte vi uttrycken av CD31 och a-SMA i cerebral ischemisk penumbra-homogenat. Våra data visade att TGs påfallande förbättrade uttrycken av CD31 och a-SMA. Det fanns dock inga signifikanta skillnader mellan PSs och OSs grupper. Därför drog vi slutsatsen att TG kan minska hjärnskador genom att främja angiogenes genom att öka uttrycken av CD31 och a-SMA, medan PS och OS inte gav något sådant skydd mot hjärnskador. Dessa resultat bekräftade vidare att endast TG:er kunde förhindra cerebral I/R-skada.

Ischemisk stroke kan ses som ett resultat av cerebral ischemi orsakad av försämring av den neuronala plasticiteten eller ombyggnad av hjärnområden. Majoriteten av strokepatienter lider av neurologiska underskott. Aktivering av neurogenes är en lovande strategi för strokepatienter för att förbättra sina neurologiska funktioner. Neurogenes deltar direkt i återhämtning av neurologisk funktion efter hjärnans I/R-skada. Tidigare forskning visar att TG kan förbättra överlevnaden för hippocampus pyramidala celler och inducera neurogenes. Oxidativ stress orsakar förlust av neuroner under många sjukdomar, såsom Parkinsons, stroke och så vidare. Nrf-2 transkriberar massor av gener relaterade till neuroskydd i deras promotorregion, främst inklusive SOD, MDA, CAT och g-glutamylcysteinligaser, etc. SYN, PSD-95 och MAP{{ 4}}-proteiner, som är nära förknippade med synaptisk bildning och neurotransmission, kan betraktas som markörer för forskning om neuronal plasticitet i den ischemiska penumbraregionen. Efter att ha studerat fann vi att botemedlet med TGs signifikant kunde öka uttrycken av PSD95, SYN och MAP -2, vilket indikerar att det cerebrala skyddet av TGs var korrelerat med förbättrad neuronal plasticitet under I/R. Det är dock synd att det inte finns någon uppenbar skillnad mellan PS-grupper och OS-grupper. Dessa resultat indikerade att TGs kunde förbättra neuroplasticiteten efter cerebral I/R-skada.

Avbildningsforskning av strokepatienter visade att BBB-dysfunktion kan ses som en slående egenskap hos den peri-ischemiska hjärnan (Bang et al., 2007). TJ:erna, som är sammansatta av cytoplasmatiska proteiner, transmembranproteiner och kopplingsadhesionsmolekyler mellan kapillära endotelceller, är mycket viktiga för att upprätthålla BBB-integritet (Ye et al., 2019). Bland dem är ZO-1, claudin-5 och occludin de viktigaste proteinerna i TJ. Uppbyggande bevis tyder på att den ökade permeabiliteten för BBB inducerad av ischemi i allmänhet korrelerar med förändringarna av ZO-1, claudin-5 och occludin (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018). I detta arbete visade resultaten att även om TGs signifikant kunde öka uttrycken av ZO-1, claudin-5 och occludinproteiner i MCAO-inducerade hjärnvävnader, så gjorde varken PSs eller OSs det. BBB består av cerebrala endotelceller och är nära förknippad med pericyter (Nyul-Toth et al., 2016). Pericyter är avgörande för BBB-integritet (Bell et al., 2010). Ischemisk stroke utlöser pericytdöd och lossnar från hjärnens endotelceller i den akuta fasen, vilket destabiliserar mikrovaskulaturen och förändrar BBB-egenskaper (Zechariah et al., 2013). Våra data visade att TG kunde öka pericyttäckningen på kapillärer och öka uttrycksnivåerna av ZO-1, claudin-5 och occludin. Dessa fenomen visade att TG effektivt kunde skydda BBB-integritet efter cerebral I/R-skada. Sammanfattningsvis kan TG:er dämpa hjärnskada på flera sätt, såsom att främja angiogenes, förbättra neuronal plasticitet och bibehålla integriteten hos BBB.

Vi undersökte sedan signalvägen för att utforska mekanismen som ligger bakom TGs hjärnskydd. Processen med I/R-skada är multifaktoriell, och därför är många mekanismer involverade i patogenesen. Oxidativ stress är en grundläggande riskfaktor som bidrar till I/R-inducerad hjärnskada, såsom BBB-strukturskada, vaskulär endotelial dysfunktion och förvärring av ischemisk neuronal skada. Således har oxidativ stress blivit ett attraktivt terapeutiskt mål vid I/R-inducerad hjärnskada. Fas 2-enzymer, som förmedlas av nukleär faktor E2-relaterad faktor-2 (Nrf-2), har ansetts vara ett viktigt sätt genom vilket neuroner skyddar sig mot oxidativ stress. Allt fler bevis tyder på att aktivering av Nrf-2 under I/R är ett potentiellt terapeutiskt mål för neuroskydd. Nrf-2, som en viktig regulator av endogent antioxidantförsvar, förmedlar nivån av hemoxygenas 1 (HO-1) och andra antioxidantenzymer, såsom NAD(P)H kinonoxidoreduktas 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH och MDA. Dessutom spelar Nrf-2 en viktig regulatorroll i angiogenes. Den aktuella studien visar att Nrf-2 kan förbättras och aktiveras avsevärt i processen för vaskulär utveckling.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ANTI-ISKEMISK STROKE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Som tidigare beskrivits innehåller TG massor av bioaktiva föreningar, till exempel echinakosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid och 2'-acetylacteosid, och några av dem visade neuroprotektiva funktioner efter cerebral I/R-skada. Echinakosid har massor av farmakologiska effekter, såsom antioxidation, anti-åldring, neuroprotektion, anti-inflammation, främjande av cicatrization, hepatoprotection, främjande av benbildning och anti-tumöraktiviteter. Nyligen har echinakosid identifierats som en potent antioxidant i det centrala nervsystemet. Echinakosid kan minska MDA-innehållet och förbättra aktiviteterna hos SOD och GSH-Px vid ischemi hjärnskada, och molekylär dockningsanalys visade att echinakosid kan binda till Keap-1, vilket leder till Nrf-2 nukleär translokation. Studien av Xia visade att akteosid kunde minska infarktvolymen och hjärnans vatteninnehåll för att förbättra neurologiska underskott hos MCAO/R-råttor genom att mildra oxidativ stress. Andra studier har visat att isoakteosid kan öka aktiviteten hos cellulära antioxidantenzymer, SOD och CAT i H2O2-behandlade V79-4-celler. Baserat på ovanstående rapporter om de aktiva föreningarna som ingår i TG är det möjligt att sluta sig till att TG kanskydda mot ischemisk stroke via antioxidationsvägarna.

Li rapporterade om de neuroprotektiva effekterna av fenyletanoidglykosider (PhGs) på H2O2-inducerad apoptos på PC12-celler via Nrf2/ARE-vägen (Li et al., 2018). Dessa PhG undertrycktes signifikant genom att trigga Nrf2 nukleär translokation och öka uttrycken av HO-1, NQO1, glutamatcysteinligaskatalytisk subenhet (GCLC) och glutamat-cysteinligasmodifierande subenhet (GCLM) (Li et al., 2018) ; Gong et al., 2019). Därför tyder dessa fynd på att Nrf-2/ARE-vägen spelar en avgörande roll i PhGs-medierade skyddande effekter på neuronala celler. På liknande sätt, i denna studie fann vi att TGs kunde minska nivån av MDA och öka nivåerna av SOD, CAT och GSH-Px i I/R-råttorna. Under tiden kunde TGs uppreglera Nrf2-uttrycket i kärnan, nedreglera motsvarande uttryck i cytoplasman och signifikant minska Keap-1-uttrycket. Därför kan Nrf-2/Keap-1-vägen vara involverad i TGs-medierade neuroprotektiva effekter. Ytterligare validering av denna väg kommer att utföras in vitro-cellodling med modeller för syre-glukosbrist/återsyreskada i framtiden. Dessutom administrerades C. deserticola-extrakt i vår studie under 14 dagar kontinuerligt. Eftersom neurogenes hos vuxna skulle påverka tolkningen av neuroprotektiva effekter under 14 dagars reperfusion, kan neurogenes inte uteslutas från vår nuvarande experimentdesign för att utforska den neuroprotektiva effekten av CT. Detta är begränsningen för vår forskning.

Sammanfattningsvis är det TG från C. deserticola som kanförbättra angiogenes och neurogenessamt bibehålla integriteten hos BBB i I/R-skadade råttor, men inte PS och OS. Effekterna kan förmedlas genom aktiveringen av Nrf-2/Keap-1-vägen.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR BEHANDLING AV ISCHEMISK STROKE PHGS75% ECH 30% ACT 12%