Viabilitet och antioxidanteffekter av traditionellt kylande rispulver (bedak Sejuk) gjord av Oryza Sativa Ssp. Indica And Oryza Sativa Ssp. Japonica på UVB-inducerade B164A5 melanomceller

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ahmad Rohi Ghazali1*, Raveena Vaidheswary Muralitharan1, Chan Kam Soon1, Tharsini Salyam1, Nurul Najihah Ahmad Maulana1, Ummul Aqeela Balqees Mohamed Thaha1, Rasyidah Mohamad Halim1, Sajidah Suhaifiq1, Ad Muhamad Haflis, Ad Muhamad Haflis, 1 M Muhamad Haflid, Ahmad Haflis

Abstrakt

Bakgrund:Traditionellt kylande rispulver (bedak sejuk) är ett fermenterat risbaseratkosmetisksom appliceras topiskt på ens hud, som en ansiktsmask över natten. Enligt användarens vittnesmål,bedak sejukförskönar och blekar huden, varigenom dessa fördelar kan användas som ett potentiellt kemopreventivt medel mot melanom.

Mål:Därför syftade denna studie till att fastställa effekterna avbedak sejuktillverkad av Oryza sativa ssp. indica (Indica) och Oryza sativassp. japonica (Japonica) på UVB-inducerade B164A5 melanomceller, och även identifieraantioxidantkapacitet för båda typerna av bedak sejuk.

Metoder:Den optimala dosen av Indica och Japonica bedak sejuk för att behandla cellerna bestämdes via MTT-analysen. Sedanantioxidantkapacitet hos båda typerna avbedak sejukbestämdes med användning av FRAP-analysen.

Resultat:Från MTT-analysen fann man att Indica och Japonica bedak sejuk inte visade några cytotoxiska effekter på cellerna. Därför kan ingen IC50 erhållas och två av de högre doserna, 50 och 100 g/L valdes för behandling. I FRAP-analysen visade Indica bedak sejuk vid 50 och 100 g/L FRAP-värden på 0,003 ± 0,001 ug AA (askorbinsyra)/g bedak sejuk och 0,004 ± 0,0003 ug AA/g avbedak sejuk. Medan Japonica bedak sejuk vid 50 g/L hade samma FRAP-värde som Indica bedak sejuk vid 100 g/L. När det gäller Japonica bedak sejuk vid 100 g/L visade den högstantioxidantkapacitet med FRAP-värdet på {{0}}.01 ± 0,0007 ug AA/g bedak sejuk vilket var statistiskt signifikant (p < 0,05) jämfört med andra testade koncentrationer.

Slutsats:Sammanfattningsvis, Japanicabedak sejukhar en högreantioxidantkapacitet jämfört med Indica bedak sejuk trots att båda inte är cellgifter mot cellerna. Oavsett vilket måste ytterligare undersökningar göras innan bedak sejuk kan utvecklas som potentiella kemopreventionsmedel mot melanom.

Nyckelord:Bedak sejuk- jäst ris- jästkosmetika- Oryza sativa Indica- Oryza sativa Japonica

Klicka tillcistancheextrakt och cistanche deserticola ma för antioxidant

Introduktion

Människokroppens största organ är huden, som står för 16 procent av den mänskliga kroppsvikten. Hudens epidermis fungerar som ett skyddande lager som separerar organismer från den yttre miljön. Detta är avgörande för att motverka miljöpåfrestningar som ultraviolett (UV) ljus. När UV-ljus tränger in i epidermis bildar melaninpigmenten i keratinocyter ett skyddande skydd ovanför keratinocyternas kärnor. Detta ger skydd för huden mot UV-ljuspenetrering samt neutraliserande reaktiva syrearter (ROS) som har producerats (D'Orazio et al., 2013; Aluwi et al., 2016; Woolridge Cooper, 2018).

Ökad exponering för UV-ljus är dock den främsta orsaken till hyperpigmentering och hudskador (Chan et al., 2014; American Cancer Society, 2020). UV-ljuset från solen som penetrerar huden är UVA (90 - 95 procent ) och UVB-strålar (5 – 10 procent), varvid omfattningen av hudskador är beroende av våglängden för varje stråle. UVA-strålar har längre våglängder (320 – 400 nm) som tränger djupt in i dermis och resulterar i bildning av fria radikaler, speciellt ROS. När det gäller UVB-strålar, med kortare våglängder (280 – 320 nm) som penetrerar endast till epidermisskiktet, skadar strålarna DNA som i sin tur orsakar mutationer. Denna kombination av ROS-formationer och mutationer bidrar i slutändan till utvecklingen av hudcancer (Sander et al., 2003; Pfeifer och Besaratinia, 2012; D'Orazio et al., 2013; Kamarulzaman et al., 2017; Pavel et al., 2017; Nagapan et al., 2018).

En typ av hudcancer som uppstår på grund av överexponering för UV-ljus är melanom. Melanom uppstår när melanocyter växer utom kontroll på grund av mutationer i DNA. Även om melanom bara står för mindre än 10 procent av all hudcancer, bidrar det till majoriteten av hudcancerrelaterade dödsfall. Detta kan tillskrivas melanoms höga metastatiska potential och motståndskraft mot terapi (Pfeifer och Besaratinia, 2012; American Cancer Society, 2020). Därför är kemopreventionsstrategier för melanom mer lämpade för att hantera denna sjukdomsförekomst (Chhabra et al., 2017).

I linje med melanom kemoprevention strategier, idén att använda en lokalkosmetiskprodukt som har potential att minska ROS-generering och mutation på mänsklig hud uppstod. Denna produkt, traditionellt kylande rispulver, mer känd sombedak sejuki Malaysia, är en traditionell jäst risbaserad kosmetisk produkt. Riskorn som har fermenterats i tidigare studier för att producera bedak sejuk är Oryza sativa ssp. indica (Indica) och Oryza sativa ssp. japonica (Japonica) (Dzulfakar et al., 2015a). Indica-riskorn är långa, platta, smala, splittras lätt och har hög amyloshalt medan Japonica-riskorn är korta, runda, splittras inte lätt och har låg amyloshalt (Ricepedia, nd). Bedak sejuk som en produkt av riskornsjäsning är i form av vattendroppar eller konformade pastiller. När dessa pastiller blandas med vatten och appliceras på huden som en ansiktsmask över natten ger den en kylande effekt. Det har stöds av användarvittnesmål från generation till generation, som hävdade att bedak sejuk kan försköna såväl som bleka hud (Dzulfakar et al., 2015b; Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018). Dessa vittnesmål har dock aldrig testats i laboratoriemiljö, särskilt på dess effekter på hudceller både normala och maligna.

Därför syftade vår studie till att fastställa effekterna avbedak sejukgjorda av risunderarterna Indica och Japonica med hjälp av UVB-inducerade B164A5 melanomceller, samt att identifieraantioxidantkapacitet för båda typerna av bedak sejuk.

Material och metoder

Beredning av Indica och Japonica bedak sejuk

Debedak sejukgjorda av risunderarterna Indica och Japonica erhölls från Faculty of Engineering and Built Environment, Universiti Kebangsaan Malaysia, 43600 Bangi, Selangor. För att bereda bedak sejuk blötlades Indica- och Japonica-riskorn i kranvatten i ett förhållande av 1:1 (vikt/volym) i separata slutna behållare som inte var steriliserade. Riskornen fick sedan genomgå naturlig jäsning i 14 dagar vid rumstemperatur. På den 14:e dagen filtrerades riskornen med en muslinduk och blötlades igen i en ny sats vatten (vikt/volym). Blötläggningen av riskornen upprepades sex gånger var 14:e dag, vilket förde den totala blötläggningsprocessen till 84 dagar. Efter 84 dagar samlades den resulterande rispastan från varje risunderart och torkades i en ugn för att producera den pulveriserade formen av bedak sejuk (Dzulfakar et al., 2016a). Bedak sejuk förvarades sedan i kylskåp vid 4oC tills vidare användning. Före experiment löstes bedak sejuk i destillerat vatten och filtrerades genom ett 0,22 µm Millipore sprutfilter för sterilisering.

Cell kultur

Den murina melanomcellinjen B164A5 köptes från European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC). Cellerna odlades i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) berikat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS), 1 procent Penicillin-Streptomycin-blandning (Pen/Strep, 10,000 IE/ml), glukos och L- glutamin. Cellerna inkuberades sedan i en fuktad atmosfär vid 37oC i 5 procent CO2. När cellsammanflödet når 80 procent sub-odlades cellerna (Public Health England, nd). Innan analyserna genomfördes plottades tillväxtkurvan för B164A5-cellerna. Från tillväxtkurvan erhölls dubbleringstiden på 24 timmar, varvid detta fynd stöddes av en studie från Danciu et al., (2013).

MTT-analys

Cytotoxiciteten hos båda typerna avbedak sejukmot B164A5-celler utvärderades genom 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) cellviabilitetsanalysen enligt metoden enligt Mosmann (1983) med små modifieringar. 200 µL av 5 x 104 celler såddes i en 96-brunn med platt botten och inkuberades i 24 timmar i en fuktad atmosfär vid 37oC i 5 procent CO2. Efter 24 timmars inkubation kasserades mediet och ersattes med 200 µL PBS. Därefter exponerades cellerna för UVB-strålning vid 30 mJ/cm2 under 36,4 sekunder (Lin et al., 2002). Direkt efter UVB-exponeringen kasserades PBS och cellerna behandlades med båda typerna av bedak sejuk i serieutspädda koncentrationer på 6,25, 12,5, 25, 50 och 100 g/L. När det gäller den positiva kontrollen behandlades cellerna med menadion i serieutspädda koncentrationer på 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 och 1 mM enligt Basri et al., (2015), medan den negativa kontrollen var de obehandlade cellerna. Efter behandling inkuberades cellerna i ytterligare 24 timmar. Efter inkubationsperioden tillsattes 20 µL 5 mg/ml MTT-lösning till varje brunn och inkuberades i 4 timmar. Sedan kastades 190 µL blandning från varje brunn och 200 µL DMSO tillsattes och inkuberades i 15 minuter. Slutligen skakades plattan under 5 minuter och absorbansavläsningar gjordes vid 570 nm med användning av en mikroplattläsare. Procentandelen cellviabilitet beräknades med hjälp av följande formel: Cellviabilitet ( procent )= (medel-OD för behandlade celler)/(medel-OD för negativ kontroll) ×100

Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) analys

Deantioxidantkapacitet hos båda typerna avbedak sejukbestämdes via FRAP-analysen såsom beskrivits av Benzie och Strain (1996). Det är en metod för att utvärdera antioxidantkraften genom reduktion av järn (Fe3 plus ) till järnjoner (Fe2 plus ) vid ett lågt pH som resulterar i bildandet av färgat järn-tripyridyltriazinkomplex. Först framställdes FRAP-arbetsreagenset färskt genom att blanda acetatbuffert (30 mM, pH 3,6), järn(III)klorid (FeCl3)-lösning (20 mM) och TPTZ-lösning (10 mM) i förhållandet 10:1:1 . Det preparerade FRAP-arbetsreagenset hölls sedan i ett vattenbad vid 37oC och skyddades från ljus. Detta följs av framställning av järn(II)sulfat (FeSO4) kalibreringskurvan med serieutspädda koncentrationer som sträcker sig från 100 – 1,000 µM. Askorbinsyra användes som positiv kontroll och hade framställts med serieutspädda koncentrationer som sträcker sig från 3,125 – 50 µg/ml, i mörker (Hasiah et al., 2011). När det gäller de experimentella stegen tillsattes 50 µL FeSO4, askorbinsyra och båda typerna av bedak sejuk till deras tilldelade brunnar i en 96-brunnsplatta. Därefter tillsattes 175 µL uppvärmt FRAP-arbetsreagens i varje brunn. Därefter inkuberades plattan vid 37°C i 5 minuter. Slutligen togs absorbansavläsningarna vid 595 nm med en mikroplattläsare och FRAP-värdena uttrycktes som askorbinsyraekvivalent antioxidantkapacitet (AEAC) (Gashahun och Solomon, 2019).

cistanche pulver

Statistisk analys

Programvaran SPSS v25 användes för datapresentation. Varje testdata från tre oberoende experiment (n=3) uttrycktes som medelvärde ± SEM. Ett envägs ANOVA-test användes för jämförelse mellan medelvärden. Alfa som användes var 0.05 och p-värde < 0,05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">

Resultat

Cytotoxicitet hos Indica och Japonica bedak sejuk

Cytotoxiciteten hos båda typerna avbedak sejukutvärderades mot UVB-inducerade B164A5-melanomceller via MTT-analysen. Menadion, som användes som positiv kontroll visade cytotoxicitet med en IC50 på 0.04 ± 0.02 mM (Figur 1). Varje koncentration av menadion var statistiskt signifikant (p < 0,05)="" jämfört="" med="" den="" negativa="" kontrollen.="" medan="" indica="" och="" japonicabedak="" sejuk="" inte="" visade="" någon="" cytotoxicitet,="" så="" erhölls="" inga="" ic50-värden.="" båda="" typerna="" av="" bedak="" sejuk="" hade="" en="" minskning="" av="" cellviabiliteten="" i="" början="" men="" ökade="" gradvis="" när="" koncentrationen="" ökade="" (figur="" 2="" och="" 3).="" dessutom="" var="" alla="" koncentrationer="" av="" båda="" typerna="" av="" bedak="" sejuk="" inte="" statistiskt="" signifikanta="" (p=""> 0,05) jämfört med den negativa kontrollen. Resultaten visade att båda typerna av bedak sejuk inte var cytotoxiska för UVB-inducerade B164A5-melanomceller.

Antioxidantkapacitet hos Indica och Japonica bedak sejuk

Den reducerande förmågan hos båda typerna av bedak sejuk asantioxidanterbestämdes genom FRAP-analysen. FRAP-värdena uttrycktes som askorbinsyraekvivalent antioxidantkapacitet (AEAC) i enheten µg AA (askorbinsyra)/g bedak sejuk. FRAP-värdena för 50 och 100 g/L Indica bedak sejuk var 0.003 ± {{ 17}}.001 respektive 0,004 ± 0,0003 µg AA/g bedak sejuk (Figur 4). När det gäller Japonica bedak sejuk var FRAP-värdena för 50 och 100 g/L 0,004 ± 0,0003 och 0,01 ± 0,0007 µg AA/g avbedak sejukvisar ett dosberoende sätt (Figur 4).

När FRAP-värdena för Indica bedak sejuk för 50 och 100 g/L jämfördes var det inte statistiskt signifikant (p=0.803). Men FRAP-värdena för Japonica bedak sejuk för 50 och 100 g/L var statistiskt signifikanta (p=0.006) vid jämförelse. Dessutom var FRAP-värdet för Japonica bedak sejuk för 100 g/L som visade den högsta antioxidantkapaciteten statistiskt signifikant jämfört med FRAP-värden för Indicabedak sejukför både 50 (p=0.001) och 100 g/L (p=0.003).

Diskussion

På senare tid har användningen av naturliga produkter inom hudvård visat en ökande trend. De flesta av dessa naturliga produkter har visat sig haantioxidantegenskaper förutom att ge skydd åt huden mot UV-ljus (Abdul Wahab et al., 2014). Ett exempel på en sådan produkt är bedak sejuk, en fermenterad risbaserad kosmetisk produkt. I generationer,bedak sejukPastiller blandas med vatten och appliceras topiskt på ens hud som en ansiktsmask över natten (Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018).

I fermenteringen av riskorn för att producera bedak sejuk är mjölksyrabakterier (LAB) vanligtvis involverade, tillsammans med mögel och jäst (Dzulfakar et al., 2015a; Dzulfakar et al., 2016b). Användningen avkosmetiskprodukter som har denna LAB-fermenterade riskomponent resulterar i expansion och jämnhet av produkten samt en våt känsla vid applicering på huden (Sawaki et al., 2010). En liknande upplevelse rapporteras också avbedak sejukanvändare, varvid appliceringen av bedak sejuk ger en sval känsla (Dzulfakar et al., 2015a). Det finns också ett intressant förhållande mellan huden och jäsningen av LAB, varvid LAB-blötläggningsvattnet som används under jäsningen av riskorn innehåller mjölksyra och andra aminosyror som bidrar till hudens återfuktning. Dessa fördelar gör LAB blötläggningsvattnet användbart som en kosmetisk produktkälla. Därför kan kombinationen av ett substrat eller medium som riskorn och LAB-stammarna åstadkomma kosmetiska effekter som antioxidanteffekter, pH-kontroll och förebyggande av cellstress (Izawa och Sone, 2014). Dessa fördelar är i linje med kemopreventionsstrategier för melanom. Bedak sejuk har dock ännu inte undersökts för dess effekter på maligna hudceller i laboratoriet. Som en preliminär studie för ett potentiellt kemopreventionsmedel för melanom är B164A5 murina melanomceller som har UVB-inducerade en lämplig cancermodell.

För det första, i MTT-analysen, fann man att Indica och Japonicabedak sejukvar inte cytotoxiska mot UVB-inducerade B164A5 melanomceller. Det noterades dock att det fanns en minskning av cellviabiliteten vid lägre koncentrationer av bedak sejuk, följt av en ökning av cellviabiliteten vid högre koncentrationer av bedak sejuk. Denna minskning av cellviabilitet kan tillskrivas det faktum att UVB-strålar är cytotoxiska mot celler, i detta fall B164A5-celler (Pavel et al., 2017). Samtidigt var lägre koncentrationer av bedak sejuk inte tillräckligt för att öka antalet celler som har UVB-inducerats. Oavsett vilket föll minskningen i cellviabilitet inte under 50-procentsgränsen och därför kunde ingen IC50 erhållas för båda typerna av bedak sejuk. Som ett resultat valdes två av de högre doserna, 50 g/L och 100 g/L, som behandlingsdoser för nästa analys.

I FRAP-analysen fann man att Japonica bedak sejuk hade en högreantioxidantkapacitet jämfört med Indicasbedak sejuk. Skillnaderna kan förklaras av det faktum att Japonica-riskorn odlas i tempererade och kallare regioner i Asien, medan Indica-riskorn odlas i hela det tropiska Asien (Garris et al., 2005). Omgivningstemperaturen spelar en viktig roll i växternas antioxidantaktiviteter, och växter som odlas i kallare väder har mer uttalade antioxidantaktiviteter i motsats till växter som odlades i varmare väder. Denna ökning av antioxidantaktivitet kan tillskrivas produktionen av fler fytokemikalier då växterna utsätts för stress i kallare väder (Kumar et al., 2017).

Det finns också andra fermenterade risprodukter som har uppvisat lovande resultat. För det första finns det Galactomyces ferment filtrate (GFF) som är en biprodukt av risjäsning av Galactomyces-jästen. GFF-extraktet innehåller en unik blandning av vitaminer, mineraler, små peptider och oligosackarider som används somkosmetiskingredienser i hudvårdsprodukter. Utdraget har visatantioxidantegenskaper genom att skydda normala humana epidermala melanocyter (NHEM) från oxidativ stress (Woolridge Cooper, 2018). Dessa fynd av GFF liknade resultaten avbedak sejuki den här studien.

Riskli har också starka antioxidantaktiviteter till den grad att de resulterar i cytotoxicitet mot melanocyter. Men när risklidet fermenteras har risklidextraktets cytotoxicitet mot B16F1-celler eliminerats. Detta visar att jäsningen av riskjärna producerade nya fördelaktiga föreningar med biologiska funktioner, även om de exakta föreningarna ännu inte har klarlagts (Chung et al., 2009).

Slutligen riset blötläggning vatten från pulvret avbedak sejukinnehåller faktiskt aminosyror som kan vara fördelaktiga för kosmetiska applikationer. Det finns 16 av 17 aminosyror som upptäckts i Indica bedak sejuk såväl som i dess blötläggningsvatten. Glutaminsyra var den högsta koncentrationen av aminosyra som fanns i både Indica bedak sejuk och dess blötläggningsvatten (Johar et al., 2018). Glutamin (ett glutaminsyraderivat) är tillsammans med arginin, tyrosin och lysin som detekteras i bedak sejuk och dess blötläggningsvatten bland de viktigaste aminosyrorna som används i kosmetiska industrier (Ha et al., 2018). Dessutom finns aminosyror ikosmetiskprodukter fungerar somantioxidanter(Ivanov et al., 2013) och aminosyrahalten i Indica bedak sejuk var mycket högre jämfört med dess blötläggningsvatten. Därför var appliceringen av bedak sejuk mer effektiv när det gäller aminosyror jämfört med blötläggningsvattnet (Johar et al., 2018).

Sammanfattningsvis Indica och Japonicabedak sejukbehöver undersökas ytterligare innan de kan sägas ha potential som ett kemopreventionsmedel mot melanom som kan (1) förhindra melanom, (2) förhindra utveckling av malignt melanom från pre-maligna lesioner eller (3) förhindra återkomst av melanom efter framgångsrik melanombehandling (Chhabra et al., 2017).