Kronisk njursjukdom ökar cerebrala mikroblödningar hos mus och man

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Wei Ling Lau1,2 & Ane C. F. Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H Cribbs3 & Mark Fisher6,7

Mottaget: 25 augusti 2018 /Reviderad: 28 januari 2019 /Godkänd: 22 februari 2019 /Publicerad online: 4 maj 2019

# Författaren/författarna 2019

Cistanchekan lindranjursjukdom

Abstrakt

Hjärnmikroblod ökar ikronisknjuresjukdom(CKD) och deras närvaro ökar risken för kognitiv nedgång och stroke. Vi undersökte interaktionen mellan CKD och hjärnmikrohemorrages (det neuropatologiska substratet för mikroblod) i mus- och cellodlingsmodeller och studerade utvecklingen av mikroblodsbelastning på seriell hjärnavbildning från människor. Musstudier: Två CKD-modeller undersöktes: adenininducerad tubulointerstitiell nefrit och kirurgisk 5/6 nefrektomi. Cellodlingsstudier: bEnd.3 Endotelceller i mushjärnan odlades till sammanflöde och monolagerintegritet mättes efter exponering för 5–15 % humant uremiskt serum eller ökande koncentrationer av urea. Mänskliga studier: Progression av hjärnmikroblödningar utvärderades på seriell MR från kontroll-, predialys-CKD- och dialyspatienter. Mikrohemorrages ökade 2-2,5 gånger hos möss med CKD oberoende av högre blodtryck i 5/6 nefrektomimodellen. IgG-färgning ökade hos CKD-djur, i överensstämmelse med ökad permeabilitet för blod-hjärnbarriären. Inkubation av bEnd.3-celler med uremiskt serum eller förhöjt urea gav en dosberoende minskning av transendotelial elektrisk resistans. Förhöjd urea inducerad aktin cytoskelett rubbningar och minskad claudin-5 uttryck. Hos försökspersoner var prevalensen av mikroblod 50 % i båda CKD-kohorterna jämfört med 10 % i åldersmatchade kontroller. Fler patienter i dialyskohorten hade ökat mikroblödningar vid uppföljande MR efter 1,5 år. CKD stör blod-hjärnbarriären och ökar hjärnans mikrohemorrager hos möss och mikroblod hos människor. Förhöjd urea förändrar aktincytoskelettet och snäva korsningsproteiner i odlade endotelceller, vilket tyder på att denna mekanism förklarar (åtminstone delvis) de mikrohemorrager och mikroblod som observerats i djur- och humanstudier.

Nyckelord Kronisk njursjukdom. Mikroblod. Mus modell. Endotelcellsodling. BrainMRI

för att lindrakronisknjuresjukdom medcistanche

Införandet

En av de viktigaste upptäckterna av strokeneurologi de senaste åren är framväxten avkronisknjuresjukdomatt ha en inverkan som går långt utöver traditionella riskfaktorer som högt blodtryck och diabetes [10, 11]. Med tanke på den höga prevalensen (cirka 50%) av cerebrala mikroblödningar och kognitiv försämring hos patienter med avancerad CKD [2-4, 6, 7], förtjänar detta förhållande ytterligare studier.

Cerebrala mikroblödningar är små foci av hemosiderin-järn som kan påvisas vid magnetisk resonanstomografi (MRT), som tros återspegla underliggande cerebrala mikrohemorrages [12, 13], och indikerar ökad risk för stroke, både hemorragisk och ischemisk [9, 14]. Specifika MR-sekvenser (gradienteko och känslighetsviktad avbildning) visar dessa fokala områden för signalförlust i hjärnparenkym som mäter ≤ 10 mm [12, 15]. Cerebrala mikroblödningar är åldersberoende, med prevalens som närmar sig 20% vid 65 års ålder [16]. Förutom ålder är hypertoni och cerebral amyloidangiopati de bäst beskrivna riskfaktorerna för utveckling av mikroblödningar [13, 17]. I sen fas CKD finns mikroblod i upp till 50% av befolkningen [2-4].

Samtidigt är kognitiv försämring både vanligare och allvarligare vid lägre nivåer avnjurefunktion[18], når en prevalens på 30–70% hos patienter med kronisk dialys [6, 7]. I en tvärsnittsanalys av 338 hemodialyspatienter i åldern 55 år och äldre med åldersmatchade kontroller hade 34 % av dialyspatienterna en allvarlig kognitiv försämring jämfört med 12 % av kontrollerna [6]. Ytterligare 35% av dialyskohorten hade måttlig kognitiv försämring [6].

Flera studier i icke-CKD-kohorter har visat en stark koppling mellan cerebrala mikroblödningar och minskande kognitiv funktion [19–22]. Epidemiologiska data stöder samexistensen av MR-mikroblodsbörda och kognitiv dysfunktion hos patienter med njursjukdom i slutstadiet (ESRD) [8, 23]. Dessutom visade en ny rapport från 28 kroniska dialyspatienter med seriell hjärn-MR en koppling mellan nya mikroblödningar och en minskning av MINI-Mental State Examination (MMSE) poäng [4]. Vidare har ESRD-patienter en 3- till 4-faldigt högre incidens av både ischemisk och hemorragisk stroke jämfört med den allmänna befolkningen [5]. I en kohort av japanska hemodialyspatienter som var strokefria vid baseline var närvaron av cerebrala mikroblödningar en oberoende prediktor för intracerebral blödning under en 5-årig uppföljningsperiod [9].

Här rapporterar vi resultat från studier på möss och på CKD-patienter. Vi fann ökade hjärnmikrohemorrager hos CKD-möss och beskriver nedsatt endotelial tät korsning och ac- tin cytoskelettstörning som potentiella mekanismer för mikrohemblödningsbildning i CKD-miljön. Retrospektiv analys av seriell hjärn-MR från icke-CKD, predialys och kronisk hemodialys bekräftade ESRD som en signifikant riskfaktor för progression av mikroblödningsbörda.

Metoder

Möss experiment

Försöksdjur och behandlingsgrupper

Två CKD-musmodeller undersöktes. (1) Adenin tubulointerstitiell nefritmodell: Manliga C57BL / 6J möss från Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) i åldern 10-12 veckor matades en diet innehållande 0,2% adenin i 18 dagar för att inducera kronisk interstitiell nefropati, placerades tillbaka på vanlig chow i 2 veckor och sedan åter exponerades för adenindiet i 1 vecka för att upprätthålla CKD (fig. 1a). Kontrollmöss upprätthölls på vanlig chow. (2) 5/6 nefrektomimodell: Manliga C57BL / 6J-möss i åldern 10 veckor genomgick tvåstegskirurgi vid Jackson Laboratories som involverade vänster partiell nefrektomi följt av höger total nefrektomi 1 vecka senare. Djuren levererades till labbet 1 vecka efter

andra operationen. Dessa två modeller användes för att bestämma effekten av högt blodtryck; hypertoni är ett kännetecken för 5/6 nefrektomimodellen, medan adenin-CKD är icke-hypertensiv [24].

CKD-djur randomiserades till inga lipopolysackarid (LPS) eller LPS-injektioner. (I pilotstudier de- terminerade vi att en längre varaktighet av uremi behövdes för att upptäcka en högre börda av spontana mikrohemorrager hos icke-behandlade CKD-djur; möss på adenindiet i endast 10 dagar efter den ursprungliga 18 dagars exponeringen hade 3,0 ± 0,4 mikrohemorrager per cm2.)

Fem veckor efter initial CKD-induktion och vid motsvarande ålder i kontroller fick möss intraperitoneala (i.p.) LPS-injektioner (Salmonella enterica serotype Typhimurium, L6511-10MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) för att inducera hjärnmikroblod. LPS administrerades i tre doser, 1 mg/kg vid 0, 6 och 24 timmar [25]. LPS-behandlade möss fick hydrering med subkutana saltlösningsinjektioner två till tre gånger per dag i 3 dagar efter LPS-behandling. Blodtrycket (BP) mättes 2 dagar före LPS-injektioner via svansmanschettpletysmografi (CODA-S2 flerkanalig, Kent Scientific). Alla experiment godkändes av University of California, Irvine Institutional Animal Care och Use Committee.

Vävnadsskörd och blodkemi

Möss avlivades 1 vecka efter LPS-injektioner eller vid motsvarande ålder hos icke-behandlade djur genom exsanguination med hjärtpunktering under inhalerad isoflurananestesi. En 26-gauge nål användes som en kanyl och infördes i vänster kammare, och iskall PBS-lösning applicerades med en flödeshastighet på 7-8 ml / min. Efter

perfusion i 5 min, den vänstra hjärnhalvan var snap-frusen för Western blot. Den högra hjärnhalvan och båda njurarna fixerades över natten i 4% paraformaldehyd och förvarades sedan i kall PBS före sektionering. Serum alikvoterades för blodkemi. Blodurea kväve (BUN) mättes med hjälp av det kolorimetriska kitet från BioAssay Systems (Hayward, CA). Serumkreatinin mättes med kapillärelektrofores vid O'Brien Kidney Research Core Center (UT Southwestern, Dallas, TX).

Detektion av mikrohemorrages

Hjärnorna monterades i 1,5% agaros och sektionerades med en vibratom för att generera koronala sektioner (40 μm). Var femte sektion samlades in för preussisk blå färgning för att upptäcka mikrohemorrages [26]. Preussisk blåfärgning utfördes med användning av nyberedd 5% kaliumhexacyanoferrat-tri-hydrat och 10% saltsyra. Tjugo minuter senare sköljdes sektionerna i vatten och motfärgades med kärnsnabbrött, uttorkat och täckglas. Mikrohemorrager identifierades vid × 20 förstoring eftersom lila-blå avlagringar räknade med tre injektioner gavs vid 0,6 och 24 timmar. Subkutan saltlösning hydrering gavs i 3 dagar efter LPS-injektioner. Svansblodtrycket (BP) mättes före LPS-injektioner. Möss offrades 1 vecka efter LPS-injektioner. b Representativa H&E-färgade njursektioner som visar adenininducerad tubulointerstitiell skada CKD-möss (höger panel) jämfört med normal njure från CTL-djur (vänster panel), × 20 förstoring. Skalstång = 100 μm

oberoende observatörer, och sedan beräknades medelvärdet. Bilder av de observerade positivt färgade sektionerna togs med hjälp av ett fotomikroskop (Nikon Eclipse, Japan) för tre djur per grupp för att beräkna mikroblödningsområdet. Hela bildbilder skannades och den kostnadsfria ImageJ-programvaran (version 10.2) från National Institutes of Health (www.imagej.nih.gov/ij/) användes för att

beräkna den totala hjärnytan. Antalet mikrohemorrager normaliserades till den totala hjärnytan per djur.

Västra Blotting

Hjärnhalvor för proteinanalys frystes vid tidpunkten för vävnadsuppsamling och homogeniserades i iskall vävnadsextraktionsreagens I (Thermo Fisher Scientific) kompletterad med proteashämmarcocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteinkoncentrationerna mättes med ett BCA-proteinanalyskit (Thermo Fisher Scientific). SDS-PAGE gelelektrofores gjordes med 100 μg protein per prov. Proteiner överfördes till PVDF-membran och blockerades sedan för

1 timme i 5% fettfri torr skummjölk beredd i TBS-T-buffert (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl och 0,1% Tween-20) och inkuberad med primära antikroppar riktade mot claudin-5 (utspädd 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludin (utspädd 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) och normaliserad till GAPDH intern kontroll (utspädd 1:10 000, Abcam, Cambridge, MA) i 5% fettfri mjölk TBS-T över natten vid 4 °C. Fläckarna inkuberades sedan med respektive anti-kanin eller anti-mus sekundära antikroppar i 2 timmar vid rumstemperatur. Efter tvättning med TBS-T detekterades band med hjälp av Luminescent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT).

Immunohistokemi

För att upptäcka läckage av blod-hjärnbarriären (BBB) inkuberades sektioner med biotinylerad antimus IgG sekundär antikropp vid 1:100 i 1 timme vid rumstemperatur (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Efter tvättning med PBS inkuberades sektioner i 30 minuter med avidin-biotin-peroxidaskomplex (Vector Laboratories) vid en spädning av 1:200. Färgning utvecklades med användning av 3′,3′- diaminobenzidin (DAB, Vector Laboratories) som kromo- gen. Procent yta färgad med IgG analyserades med hjälp av ImageJ-programvara i icke-LPS CTL- och CKD-hjärnor. Ett tröskelvärde för positiv IgG-färgning valdes genom att manuellt utvärdera ett kontrolldjur för IgG-färgning, och detta tröskelvärde hölls sedan lika för alla inkluderade djur [27].

Cistanche deserticola förhindrar njursjukdom

Cellodlingsexperiment

Hjärnandotelcellsodling och serumbehandling

Odödliga mus bEnd.3-celler köptes från American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Endotelcellsfenotyp bekräftades via immunfärgning för von Willebrand-faktor.

Cellkulturer inkuberades i högglukos komplett Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM, ATCC 30-2002) innehållande 25 mM glukos kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin i en fuktad inkubator vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2 och 95% luft. Celler användes vid passage 5 för alla experiment. Cellerna såddes vid 5× 106 densitet på 12-brunns polyester Transwell-insatser (0,4 μm por, Costar) och sammanflöde uppnåddes vid 24-48 timmar. Odlingsmediet ändrades sedan för att exponera celler för olika koncentrationer av FBS, humant normalt serum (HNS) eller uremiskt serum (CKD) från dialyspatienter. TEER-avläsningarna mättes med EVOM2 volt / Ohm Meter (World Precision Instruments, Sarasota, FL) på tre platser per brunn för att få ett genomsnitt. Experimenten fortsatte i 21 dagar, och odlingsmediet uppdaterades var 3-4: e dag. NHS och uremiskt serum var från tidigare bankade prover som erhållits efter IRB-godkännande och informerat samtycke.

Urea cellodling experiment

För att undersöka effekterna av urea (det vanligaste kvarhållna toxinet i CKD) inkuberades bEnd.3-celler i DMEM med hög glukoshalt med 10% FBS ensamt eller i medium kompletterat med 42 eller 72 mg / dL (70 eller 120 μm) urea (Sigma-Aldrich). Dessa ureakoncentrationer approximerar de värden före och efter hemodialys som vanligtvis finns hos ESRD-patienter och anses vara kliniskt relevanta [28]. I slutet av en 24-timmars inkubationsperiod mättes TEER och celler skördades och bearbetades för Western blot-analys. För visualisering av aktincytoskelettet odlades bEnd.3-celler på glasöverdragsglidningar och exponerades för ovanstående ureakoncentrationer i 24 timmar, fixerades i 10 minuter i kylt 4% formalin / PBS och bearbetades sedan för immunofluorescensfärgning med aktistain 488 fluorescerande falloidin med DAPI-kärnfläck (katalog # PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Tredubbla bilder gjordes per grupp och tre bilder avbildades per bild på ImageJ-programvaran för att beräkna arean av falloidinfärgning normaliserad till DAPI-området.

Västra Blotting

bEnd.3 celler från ureaexperimenten pelleterades och lyserades sedan i Tissue Extraction Reagens I (Thermo Fisher Scientific) kompletterat med proteashämmarcocktail (Roche Applied Science). Proteinkoncentrationerna mättes med ett BCA-proteinanalyskit, och Western blotting gjordes enligt beskrivningen ovan med claudin-5 (utspätt 1:500) och occludin (utspätt 1:500) normaliserat till GAPDH intern kontroll (utspädd 1:20 000). Västra fläckar upprepades minst tre gånger för varje prov.

Mänskliga studier

Retrospektiv granskning av hjärn-MR-diagram

Elektroniska journaler mellan 1 januari 2008 och 31 december 2014 vid University of California-Irvine Medical Center screenades med hjälp av Honest Broker-systemet och UCReX (University of California Research Exchange) efter IRB-godkännande. Pre-dialys CKD (n = 8) och patienter med kronisk hemodialys (n = 9) som hade minst två hjärn-MR-skanningar vid separata tidpunkter identifierades (av 10 hemodialyspatienter som ursprungligen identifierades, 1 togs bort från den slutliga analysen på grund av saknade bilder i radiologi PACS-systemet). Kontroller med normal njurfunktion (n = 10) matchades manuellt med hemodialys CKD-patienterna efter kön och ålder ± 5 år.

Granskning av MR för cerebrala mikroblödningar

Mikroblod räknades av en behandlande neuroradiolog (DF) och analyserades för progression över tiden. Hjärn-MR med T2*-viktade och känslighetsviktade im- aging(SWI) och FLAIR-bilder (vätskedämpad inversionsåtervinning) utfördes på 1,5T och 3T MR-skannrar. Skikttjockleken för SWI-sekvenser utfördes vid 2 mm, med ett mellanskiktsintervall på 0. Mikrobleeds räknades baserat på 2 mm axiell SWI. FLAIR var per-

bildad för att detektera lesioner av vit substans vid 3 mm skivtjocklek, även med ett mellanskiktsintervall på 0.

Statistisk analys

Det fanns inga dataavvikelser vid screening med Grubbs test (extrem studentiserad avvikande metod, http://graphpad.com / snabba samtal / grubbs1 /). Skillnader mellan grupper hos möss och hos människa jämfördes med chi-kvadratiska (Fishers exakta) tester för kategoriska variabler och t-tester och ANOVA för kontinuerliga variabler. Kontinuerliga data rapporteras som medelvärde ± SEM. För musdata utförde vi både en Kruskal–Wallis icke-parametrisk och en enkelriktad ANOVA med Tukey HSD-tester. Tvåvägs ANOVA (CKD-ja /nej och LPS- ja/nej) användes för att testa CKD-interaktion. Skillnader mellan grupper ansågs signifikanta om P< 0.05.="" figures="" were="" generated="" using="" graphpad="" prism="" 4="" software="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">

Resultat

Överlevnad med LPS-behandling

CKD-möss behandlade med LPS hade en överlevnad på 80%. Endast möss som överlevde till 1 vecka efter LPS-behandling var

ingår i de slutliga analyserna. Alla möss i andra grupper överlevde till slutet av experimentet.

CKD ökade signifikant hjärnans mikrohemorrages

Börda efter LPS-behandling

Djur med adenininducerad och 5/6 nefrektomi CKD visade signifikant förhöjda blodureakväve (BUN) och serumkreatininvärden jämfört med CTL-djur (tabell 1). Svans BP var signifikant högre hos nefrektomi-CKD-djur jämfört med CTL- och adenin-CKD-djur (tabell1); Mikroblodsräkningarna i de två CKD-grupperna var dock likartade. H&E-färgning bekräftade adenininducerad tubulointerstitiell in- jury i njurarna från CKD-möss (fig. 1b).

Genomsnittlig hjärnmikroblödningsbörda var 2,0 ± 0,5 per cm2 hos icke-LPS CTL-möss och ökade 2-2,5 gånger hos icke-LPS CKD-djur (adenin-CKD-möss 4,5 ± 0,9 per cm2;

nefrektomi-CKD-möss 4,2 ± 1,1 per cm2) (tabell 1; fig. 2a). För icke-LPS-grupperna var en ökning av mikrohemorrager signifikant för adenin-CKD jämfört med CTL men inte för nefrektomi-CKD. LPS-behandling ökade mikroblödningsbildningen i samma grad hos CTL- och CKD-djur genom att