Nätverksfarmakologi och experimentell validering avslöjar den mekanistiska rollen för Cistanche-fenyletanoidglykosider i behandlingen av NAFLD via TNF/PI3K/Akt Pathway
Oct 29, 2025
3. Resultat
3.1 Nätverksfarmakologi
3.1.1 Aktiva föreningar och potentiella mål
Baserat på tidigare forskning från projektgruppen och information från databaser och litteratur valdes tio representativa föreningar med farmakologisk aktivitet ut [10–11]:verbaskosid, isoverbaskosid, echinakosid, 2'-acetyl-verbaskosid, cistanosid A, cistanosid B, salidrosid, isocrenatosid II, cistancheglykosid A och cistancheglykosid F.
Höghalt Verbascoside (acteosid) Cistanche-extrakt för blodlipidbehandling
Specifikationslista för Cistanche-extrakt
AnvänderSwissTargetPrediction44 mål erhölls;NetInferförutspådde de 20 bästa målen, vilket gav 45 mål;SuperPredgav 118 mål. Efter att ha slagit samman och tagit bort dubbletter,195 unika målidentifierades.
FrånGSE89632datauppsättning, som inkluderade 39 NAFLD-prover och 24 normala prover,589 differentiellt uttryckta generscreenades. Kombinera data frånGeneCardsochDisGeNET, 2 315 NAFLD-relaterade sjukdomsgenererhölls efter deduplicering (figur 1A–1B). Genom att skära sammansättningsrelaterade mål med sjukdomsmål,77 överlappande målidentifierades som potentiella terapeutiska mål för Cistanche-fenyletanoidglykosider mot NAFLD (Figur 1C).
Dessa mål importerades tillSTRÄNG database with an interaction threshold >0,400. Isolerade noder togs bort och nätverket visualiserades viaCytoscape, vilket resulterar i enPPI-nätverk med 75 noder och 408 kanter(Figur 1D). Med hjälp av funktionen "Analysera nätverk" i Cytoscape identifierades de 10 bästa målen baserat på gradvärde som kärnmål:TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1, HIF1A, STAT1, APP, PRKACA, SMAD3.
3.1.2 GO-, KEGG- och DO-anrikningsanalyser
GO anrikningsanalys avslöjade 93 termer förmolekylär funktion (MF), 38 förcellulär komponent (CC)och 989 förbiologisk process (BP). De 10 bästa bidragen i varje kategori visualiserades (Figur 2). Resultaten indikerade att Cistanche-fenyletanoidglykosider kan utöva anti-NAFLD-effekter genom vägar relaterade tillinflammation, cytokiner, metabolism och immunsvar.
DO-anrikning identifierad833 sjukdomarassocierade med målen, med de 25 översta visualiserade (Figur 4), inklusivemetabola, immun-, kardiovaskulära, fetmarelaterade och leversjukdomar, alla nära besläktade med NAFLD.
3.1.3 Nätverk "Compound–Target–Pathway".
Baserat på KEGG-anrikningsresultat, a"compound–target–pathway" nätverkbyggdes med hjälp avCytoscape 3.9.1. Gröna rutor representerar aktiva föreningar, blå cirklar representerar mål och orange V-formade noder representerar vägar (Figur 5). Detta illustrerar att Cistanche-fenyletanoidglykosider utövar anti-NAFLD-effekter genomflera föreningar, mål och vägar, medechinacoside och verbascosideär de mest förekommande och listade markörföreningarna i 2020 års upplaga avKinesisk farmakopé.
3.1.4 Molekylär dockning
De fem främsta kärnmålen i PPI-nätverket (TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1De aktiva föreningarna dockades och deras minimala bindningsenergier beräknades (Figur 6). Alla dockningspoäng var mindre än–6 kcal/mol, vilket indikerar starka bindningsaffiniteter.TNF uppvisade den starkaste affiniteten. Vissa dockningsresultat visualiserades med hjälp avPyMOL(Figur 7).
3.2 Cellexperiment
3.2.1 Effekter av FFA på lipidackumulering i HepG2-celler
Som visas iBild 8ökade FFA-koncentrationer från 0,5 till 2 mmol/L ledde till en ökning av röda lipiddroppar, som smälte samman till stora lipiddroppar, vilket indikerar framgångsrik lipidladdning.
3.2.2 Effekter av FFA och Cistanche fenyletanoidglykosider på cellviabilitet
Som visas iFigur 9A, FFA-koncentrationer av1 mmol/L och lägrehade ingen signifikant effekt på cellviabilitet (P > 0,05); således,1 mmol/Lvaldes för modellering. Som visas iFigur 9B, Cistanche fenyletanoidglykosider upp till200 μg/mlpåverkade inte viabiliteten signifikant (P > 0,05), men400 μg/mlsignifikant hämmad viabilitet (P < 0,01). Därför,25, 50 och 100 μg/mlvaldes som låga, medelhöga och höga doser för behandling.
3.2.3 Effekter på lipidackumulering
Som visas iBild 10, uppvisade modellgruppen signifikant ackumulering av röda lipiddroppar jämfört med kontrollgruppen (P < 0,01), vilket bekräftar framgångsrik modellering. Behandling med50 och 100 μg/mlCistanche-fenyletanoidglykosider minskade signifikant bildningen av lipiddroppar (P < 0,01). IBild 11, TG- och TC-nivåerna var förhöjda i modellgruppen (P < 0,01), medan alla behandlingsgrupper visade signifikant reducerade nivåer jämfört med modellgruppen (P < 0,01).
3.2.4 Effekter på mitokondriell skada
JC-1 färgämne ackumuleras i friska mitokondrier och avger röd fluorescens; i skadade mitokondrier förblir den i monomer form och avger grön fluorescens. Som visas iBild 12, dominerade röd fluorescens i kontrollgruppen, medan grön fluorescens var framträdande i modellgruppen. Behandlingsgrupper visade minskad grön fluorescens och ökad röd fluorescens, vilket tyder på förbättrad mitokondriell membranpotential.
3.2.5 Effekter på intracellulära ROS-nivåer
Som visas iBild 13, visade modellgruppen signifikant ökad fluorescensintensitet (P < 0,01), vilket indikerar förhöjd ROS. Behandling med Cistanche fenyletanoidglykosider reducerade signifikant ROS-nivåer vid alla koncentrationer (P < 0,01).
3.2.6 Effekter på apoptos
Hoechst 33342 färgar kärnor, med apoptotiska kärnor som visar klarblå, kondenserad eller fragmenterad morfologi. Som sett iBild 14, hade kontrollgruppen minimal ljus fluorescens, medan modellgruppen visade rikligt med ljusblå apoptotiska kärnor. Behandlingsgrupperna uppvisade minskad fluorescensintensitet, vilket tyder på minskad apoptos.
3.2.7 Effekter på TNF/PI3K/Akt-signaleringsväg och Bax-uttryck
Som visas iBild 15, jämfört med kontrollgruppen, visade modellgruppen signifikant förhöjd uttryck avTNF-a, PI3K p85, Akt och Baxproteiner (P < 0,05, P < 0,01). Vid behandling:
Alla Cistanche-fenyletanoidglykosidgrupper visade reduceradeTNF-auttryck (P < 0,01),
De50 μg/mlgrupp visade reduceradPI3K p85uttryck (P < 0,01),
De100 μg/mlgrupp visade reduceradAkt och Baxuttryck (P < 0,05).
4. Diskussion
NAFLD är en komplex leversjukdom associerad med metabola störningar, som involverarobalans i lipidmetabolismen, insulinresistens och oxidativ stress[12]. På senare år hartraditionell kinesisk medicin (TCM)har visat betydande lovande vid behandling av NAFLD.
Modern forskning har visat detfenyletanoidglykosider från Cistanchekan reglera lipid- och glukosmetabolismen i levern och hämma oxidativ stress, inflammation och fibros [13–15]. Levern använderβ-oxidationatt metabolisera fettsyror ochCYP7A1att omvandla kolesterol till gallsyror för lipidhomeostas [16–18]. I miljöer med hög fetthalt leder metabol obalans till lipidackumulering och NAFLD [19].
Denna studie bekräftade detFFA-inducerade HepG2-cellervisade ökade lipiddroppar och förhöjda TC- och TG-nivåer. Behandling med Cistanche fenyletanoidglykosider minskade signifikant bildning av lipiddroppar och TC/TG-nivåer, vilket förbättrade leversteatos.
Mitokondriell dysfunktion leder till minskad β-oxidation, överdriven ROS-produktion och lipidperoxidation [20]. ROS skadar ytterligare mitokondrier, förvärrar steatos [21]. Våra resultat visar att Cistanche fenyletanoidglykosiderminska ROS, förbättramitokondriella membranpotential, och lindraoxidativ stress, vilket minskar fettansamlingen.
Nätverksfarmakologi visade att anti-NAFLD-effekterna involverar flerametaboliska och apoptosrelaterade vägar. Molekylär dockning visade starka bindningsaffiniteter mellan aktiva föreningar och mål, särskiltTNF, vilket antyder dess centrala roll.
DeTNF-vägär avgörande för cellsignalering. TNF-α binder tillTNFR1, aktiverar dödsreceptorvägar och inducerar apoptos [22]. Den aktiverar ocksåPI3K/Akt väggenom parakrin signalering [23–24]. Onormal PI3K/Akt-signalering är kopplad till lipidackumulering, inflammation och fibros i NAFLD [25]. Våra data visar att Cistanche fenyletanoidglykosiderhämma apoptosoch minska uttrycket avTNF-a, PI3K, Akt, ochBax, överensstämmer med nätverksförutsägelser, vilket bekräftar vikten avTNF/PI3K/Akt väg.
Slutsats
Cistanche fenyletanoidglykosider reglerar NAFLD genomflera processer och vägar, inklusive:
Minskar lipidackumulering,
Hämmar oxidativ stress,
lindra mitokondriella skador,
Undertrycka apoptos.
Dessa effekter kan vara nära kopplade tillTNF/PI3K/Akt signalväg. Denna studie ger inte bara vetenskapligt stöd för tillämpningen av Cistanche-fenyletanoidglykosider i NAFLD-behandling utan också en referens för utveckling och klinisk forskning av nya terapeutiska läkemedel.
