Detektion och karakterisering av mineralo-organiska nanopartiklar i mänskliga njurar

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Ektopisk förkalkning är förknippad med olika mänskliga sjukdomar, inklusive ateroskleros, cancer,kronisknjuresjukdom, ochdiabetesmellitus. Även om mineralnanopartiklar har upptäckts i förkalkade blodkärl, förblir naturen och rollen för dessa partiklar i människokroppen oklar. Här visar vi för första gången den människannjurevävnader som erhållits från slutstadietkronisknjuresjukdomeller njurcancerpatienter innehåller runda, multilamellära mineralpartiklar på 50 till 1 500 nm, medan inga partiklar observeras i friska kontroller. Mineralpartiklarna finns huvudsakligen i den extracellulära matrisen som omger de invecklade tubuli, samlingskanaler och slingor av Henle samt i cytoplasman hos tubuli-avgränsande celler, och består av polykristallint kalciumfosfat som liknar det mineral som finns i ben och ektopiska förkalkningar. Denjuremineralnanopartiklar innehåller flera serumproteiner som hämmar ektopisk förkalkning i kroppsvätskor, inklusive albumin, fetuin-A och apolipoprotein A1. Eftersom de mineral-organiska nanopartiklarna inte bara finns i förkalkade avlagringar utan även i områden utan mikroskopiska förkalkningar, tyder våra observationer på att nanopartiklarna kan representera prekursorer till förkalkning och njursten hos människor.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ektopisk förkalkning är associerad med ateroskleros, cancer,kronisknjuresjukdomoch diabetes mellitus1–3. Nyligen genomförda studier tyder på att åderförkalkning ochkronisknjuresjukdompatienter med tecken på vaskulär förkalkning visar ökade risker för sjuklighet och dödlighet, vilket tyder på att ektopisk förkalkning är skadligt för människors hälsa1,3. Oönskad förkalkning observeras även hos åldrande individer och de flesta över 60 år visar tecken på vaskulär förkalkning4. Av dessa skäl är viktiga mål att dechiffrera de faktorer som inducerar ektopisk förkalkning och utveckla effektiv behandling.

Ektopisk förkalkning kan definieras som en obalans mellan inhibitorer och inducerare av förkalkning i kroppen. Förkalkningshämmare inkluderar serumproteiner som albumin, fetuin-A, osteopontin och matris GLA-protein samt små föreningar som pyrofosfat, medan hyperfosfatemi och inflammation representerar viktiga inducerare av förkalkning5–7. Nyligen genomförda studier indikerar att förkalkningsinducerare aktiverar en cellulär process som liknar benbildningen under vaskulär förkalkning7,8. Matrixvesiklar som liknar de som inducerar mineralisering i ben under utveckling har också upptäckts i förkalkade mjukvävnader7–9. Dessa matrisvesiklar frisätts troligen av vaskulära glatta muskelceller som differentierar till osteoblastliknande celler, vilket inducerar förkalkning7.

Mineralnanopartiklar (NP) har upptäckts i mjukvävnader som visar tecken på ektopisk förkalkning. Price et al. fann att serum från råttor som behandlats med antingen bisfosfonatetidronat eller med vitamin D innehåller mineral-proteinkomplex innehållande förkalkningshämmarna fetuin-A och matris GLA-protein10,11. På liknande sätt har Jahnen-Dechent et al. observerade att fetuin-A-innehållande mineralkomplex, som kallades kalciproteinpartiklar (CPP), kunde detekteras i ascitesvätskan hos patienter med förkalkande peritonit12. En färsk studie av Bertazzo et al. visade förekomsten av mineraliska NP i aortaklaffarna och kranskärlen hos patienter med både aterosklerotiska och reumatiska feber13. Medan studier på bildandet av mineralpartiklar vanligtvis har fokuserat på det mänskliga kardiovaskulära systemet, är det fortfarande oklart om partiklarna kan hittas i andra vävnader och om dessa enheter spelar en roll för hälsa eller sjukdom.

Vi observerade tidigare att mineral-organisk NPS spontant bildas i kroppsvätskor hos människor och djur14–28. Dessa mineral-NP beskrevs från början som nanobakterier (NB) och ansågs inte bara vara de minsta cellerna på jorden29, utan också en möjlig överförbar orsak till många sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom, åderförkalkning, cancer,njurestenbildning, polycystisknjuresjukdomoch prostatit30–32. Våra resultat har dock visat att NB i själva verket är icke-levande mineral-NP som härmar vanliga bakterier när det gäller deras morfologi, tillväxt, spridning och subkultur15,18,22. Möjligheten att mineralpartiklar liknande den så kallade NB kan hittas i mänskliga vävnader och om dessa partiklar spelar en roll vid sjukdom återstår att undersöka.

I denna studie utvecklade vi en nanomaterialmetod för att upptäcka och analysera mineraler-organiska NP hos sjuka människornjurevävnader. Vi visar att njurvävnader från kronisk njursjukdom i slutstadiet och patienter med njurcancer innehåller multilamellära mineral-NP: er som liknar de biomimetiska mineralpartiklarna som spontant fälls ut i kroppsvätskor in vitro. Våra resultat avslöjar kritiska insikter om den biokemiska sammansättningen, bildningsmekanismen och den biologiska funktionen hos dessa mineral-organiska partiklar och de belyser mekanismer för ektopisk förkalkning och initiering av sjukdom i människokroppen.

Resultat

Vi undersökte njurvävnad som kirurgiskt avlägsnats från mänskliga patienter med antingen kronisk njursjukdom i slutstadiet (n=2) eller njurcancer (n=18; se tabell 1; för njurcancerprover fokuserade vi på icke -cancerös del av vävnaden). Som friska kontroller studerade vi njurbiopsier erhållna från patienter med antingen trauma eller hematom men som inte hade någon tidigare onormal njurfunktion (n=2; Tabell 1).

Njurvävnader från friska individer visade normala histologiska egenskaper och ingen ektopisk förkalkning observerades efter von Kossa-färgning (Fig. 1A, B). Å andra sidan visade njurvävnader erhållna från sjuka individer och färgade med hematoxylin och eosin (H&E) tecken på vävnadsskada (Fig. 2A–C, indikerad med pilar), och 80 procent av de sjuka vävnaderna som undersöktes visade mineraliserade avlagringar som avslöjats genom von Kossa-färgning (Fig. 1C–T, Fig. 2E,F, förkalkning är synlig som svart material indikerat med svarta pilar; se även Tabell 1). Förkalkade avlagringar noterades i cortex och medulla, inklusive det extracellulära utrymmet som omger de distala hopvikta tubuli, proximala hopvikta tubuli, uppsamlingskanaler och slingor av Henle samt cytoplasman hos celler som avgränsar tubuli och kanaler (Fig. 1C–T och Fig. 1C–T och Fig. 2E, F). Ingen förkalkning upptäcktes i njurkroppen (Fig. 2D).

För att undersöka arten av mineralfällningarna förberedde vi ultratunna njursektioner för observation med transmissionselektronmikroskopi (TEM). I prover som innehåller mikroskopiska mineralavlagringar detekterades mineralpartiklar eller granuler i cytoplasman hos njurepitelceller, i den extracellulära matrisen under basalmembranet och i lumen av proximala och distala hoprullade tubuli (fig. 3A, B, partiklar är förstorade) i panelerna A1–A4 och B1–B4). Mineral NPs observerades också i celler som fodrade slingorna av Henle och uppsamlingskanaler (Fig. 3C, D, förstorade i panelerna C1, C2 och D1). Vissa partiklar hittades i intracellulära vesiklar i njurceller (Fig. 3A, panelerna A1 och A2). Elektronmikroskopimetoden som användes här gjorde det också möjligt för oss att visualisera det inre av mineralpartiklarna; vissa partiklar innehöll elektrontäta ringar alternerande med lätta, elektrongenomskinliga skikt (fig. 3A, panelerna A3 och A4, fig. 3C, panelen Cl). Flera blodkärl, såsom vasa recta rents (njurens raka artärer), vi är omgivna av ett stort antal mineral-NP (Fig. 3D, panel D1). Mineral NP:er hittades således på olika platser i alla mänskliga njurvävnader som visade tecken på ektopisk förkalkning, medan inga partiklar hittades i de friska kontrollerna som undersöktes.

Mineralpartiklarna som finns i njurvävnader verkar vara mycket lika de mineralo-organiska NP som beskrivs som spontant bildas i kroppsvätskor i våra tidigare studier15,17 (och som vi har kallat bioner24). För att verifiera denna möjlighet beredde vi mineralorganiska NP (eller bioner) med en utfällningsmetod som vi tidigare beskrivit15. Denna metod består av att tillsätta utfällande joner som kalcium och fosfat i ett cellodlingsmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium eller DMEM) innehållande en kroppsvätska som ett mänskligt serum (HS), följt av inkubation i cellodlingsförhållanden (se Metoder). Partiklarna som producerades på detta sätt (HS-NPS) var antingen sfäriska eller ellipsoida och visade en slät eller kristallin mineralyta (Fig. 4A–E), liknande de partiklar som beskrivits tidigare i kroppsvätskorna22,23 såväl som i mänsklig ascites12 och förkalkade artärer13. Mineralpartiklarna var mycket lika de mineraliska NP eller granulat som observerades i njurvävnad när det gäller deras övergripande morfologi, flerskiktsstruktur och ytegenskaper (Fig. 4F-J). Storleken på HS-härledda partiklar och njurgranulat var också jämförbara, varierande från 50 till 1 500 nm i diameter (Fig. 4A–E,F–J). Som noterats ovan omgavs vissa njurgranuler av ett lipidmembran, möjligen representerande intracellulära lastvesiklar eller extracellulära membranvesiklar (fig. 4H,I, membran betecknas med pilar); sådana membranstrukturer saknades i HS-NP-prover framställda in vitro (Fig. 4A–E). Dessa observationer tyder på att njurgranuler liknar de mineralo-organiska NP som samlats i serum.

Med hjälp av utvald area elektrondiffraktionsanalys, observerade vi att mineralfasen av HS-NPs framställda in vitro bestod av ett polykristallint nanomaterial (Fig. 4E, infälld; märk de svaga koncentriska ringarna). Liknande resultat erhölls för njurgranulat (Fig. 4J, infälld) och för ben och ektopiska förkalkningar som beskrivits i tidigare studier33,35.

Vi studerade den kemiska sammansättningen av HS-NPs och njurgranulat med hjälp av energidispersiv röntgenspektroskopi (EDX). HS-NPs visade stora toppar av kol (C), kalcium (Ca), syre (O) och fosfor (P) (Fig. 4K), i överensstämmelse med närvaron av ett kalciumfosfatmineral. En låg topp av kisel (Si) noterades också i HS-NPs (Fig. 4K), som möjligen representerar en mindre partikelbeståndsdel. Njurgranuler visade också toppar av kol, kalcium, syre och fosfor, vilket tyder på ett kalciumfosfatmineral, tillsammans med ytterligare toppar av kisel och järn (Fe) (Fig. 4L). Urantoppar (U) tillskrevs uranylacetatet som användes som kontrastreagens under provberedningen (närvaron av uran i vissa prover av mineralpartiklar som njurgranulat och dess frånvaro i kontrollvävnaden i fig. 4M kan tillskrivas den höga affinitet för uran för fosfat, som rapporterats tidigare35). Kontroll EDX-spektra av njurvävnad som omger partiklarna visade toppar av kol och syre (Fig. 4M), vilket tyder på att kalcium och fosfor återfanns huvudsakligen i mineralpartiklarna.

Förhållandet kalcium:fosfor (Ca:P) för HS-NP och njurgranulat varierade från 0.65 till 1.18. Dessa förhållanden skiljer sig från det teoretiska värdet på 1,67 som observerats för stökiometrisk hydroxiapatit men ligger fortfarande inom det intervall som setts tidigare för kalciumfosfat- och apatitkristaller observerade vid olika grader av kristallisation15. Tillsammans bekräftar dessa fynd att njurgranulerna består av kalciumfosfat-NP.

Olika proteiner har visat sig hämma ektopisk förkalkning på ett systemiskt sätt i kroppen36,37. Dessutom tros proteinet korona som finns på ytan av syntetiska NP:er bestämma biodistributionen och effekterna av partiklarna på celler in vivo38,39. Å andra sidan förblir proteinsammansättningen av mineralo-organiska NP som finns i mänskliga njurvävnader ofullständigt förstådd. Vi fann tidigare att albumin, fetuin-A och apolipoprotein-A1 (apo-A1) representerar de huvudsakliga proteinerna som interagerar med mineralo-organiska NP som bildas i kroppsvätskor17,20. Här använde vi immunogoldmärkning för att undersöka närvaron och ultrastrukturell placering av dessa proteiner i njurgranulat.

Vi använde polyklonala antikroppar mot humant serumalbumin (HSA), humant serum fetuin-A (HSF), humant apo-1A och hel HS för att undersöka närvaron av serumproteiner i HS-NPs och njurgranuler. Specificiteten för de polyklonala antikropparna (framställda såsom beskrivits tidigare25) verifierades med hjälp av Western blotting (Fig. 5). Var och en av de polyklonala antikropparna reagerade positivt med HS-NP framställda in vitro såväl som med mineralgranulerna som finns i mänskliga njurvävnader (Fig. 6A, B, panelerna A1-A3 och B1-B3; svarta prickar). Antikropparna reagerade huvudsakligen med de elektrontäta skikten eller den mörka kärnan av HS-NPs och njurgranuler (Fig. 6A, B), vilket indikerar att dessa mörka områden kan innehålla högre nivåer av proteiner jämfört med elektronlucenta områden. Negativa kontroller utförda utan primär antikropp gav ingen reaktion (Fig. 6A, B, panel A4 och B4, kontroll). Vi drog slutsatsen att njurgranuler representerar mineralo-organiska NP som liknar HS-NP baserat inte bara på deras morfologi och mineralsammansättning utan också på deras bindning till de viktigaste förkalkningshämmarna som finns i serum.

Immunfluorescensmikroskopi användes bredvid för att bekräfta närvaron av mineralgranuler innehållande HSA och HSF i sjuka mänskliga njurar. Med denna teknik visades mänskliga njurvävnader

positiv färgning för de två proteinerna i olika områden, inklusive interstitium som omger njurtubuli såväl som cytoplasman hos tubuliavgränsande celler (Fig. 7A, panelerna A1 och A2). Proteinaggregat innehållande både albumin och fetuin-A noterades också i dessa områden, om än i lägre mängder jämfört med färgningen av de enskilda proteinerna (Fig. 7A och panel A3, sammansatt färgning i gult). Noterbart noterade vi att proteinfärgningen som detekterades genom immunfluorescens nära överlappade mönstret av ektopisk förkalkning som observerades med von Kossa-färgning (Fig. 7A, B, förkalkning är synligt som svart material indikerat med pilar i B). Dessa resultat ger ytterligare stöd för närvaron av mineralo-organiska partiklar i de undersökta mänskliga njurvävnaderna.

Diskussion

Medan framsteg har gjorts i vår förståelse av interaktionerna mellan syntetiska NP och mänskliga celler, vet vi betydligt mindre om effekterna av mineralo-organiska NP som bildas spontant i kroppsvätskor. Våra tidigare studier har visat att dessa partiklar bildas i biologiska vätskor när koncentrationerna av kalcium och fosfat överstiger mättnad15,16. Vi observerade också att dessa partiklar internaliseras av immunceller men att endast stora partiklar inducerar pro-inflammatoriska immunreaktioner23. Fördelningen av dessa partiklar i mänskliga vävnader och om de spelar några fysiologiska eller patologiska roller i kroppen har dock inte undersökts hittills.

I den aktuella studien upptäckte vi för första gången mineralo-organiska NP i njurar hos mänskliga patienter som lider av antingen njursjukdom i slutstadiet eller njurcancer. De mineralo-organiska NP som detekteras innehåller dåligt kristalliserat kalciumfosfat som liknar benmineral, såväl som albumin, fetuin-A och apo-A1 som fungerar som systemiska förkalkningshämmare i kroppsvätskor. Våra resultat överensstämmer med tidigare rapporter som beskrev förekomsten av mineral-proteinkomplex i vaskulära vävnader och kroppsvätskor12,13,34,40. Eftersom partiklarna som vi observerade hittades i områden som inte innehåller några mikroskopiska förkalkningar, tyder våra observationer på att partiklarna kan representera prekursorer för ektopisk förkalkning i mänskliga vävnader. Med tanke på möjligheten att mineraloorganiska NPs gradvis kan växa i storlek och genomgå en partikel-till-film-omvandling under gynnsamma förhållanden som beskrivits i våra tidigare studier15,18, tyder de observationer som presenteras här på att mineralprekursorerna kan leda till bildandet av större mineralavlagringar in vivo, såsom Randalls plack och njursten.

Våra observationer att mineral ektopiska förkalkningar och mineraloorganiska NPs finns i olika anatomiska strukturer av njurarna överensstämmer med tidigare fynd av ektopiska förkalkninger i detta organ41. Evan et al.s observationer indikerade att mineralisering i njurarna hos patienter med nefrolitiasis kan starta och förekomma huvudsakligen i den interstitiella vävnaden i slingorna hos Henle40,42. Dessa författare observerade att mineralavlagringar som bildas i detta område kan sticka ut från den basala sidan av urotelet och leda till bildandet av njursten. Våra observationer tyder på att, förutom slingorna i Henle, andra njurområden kan innehålla mineral-NP som så småningom kan utvecklas till att bilda stora mineralavlagringar i mänskliga njurar. Vi undersöker också möjligheten att mineral-NP som bildas i blodcirkulationen kan translokera till njurvävnad och inducera ektopisk förkalkning och stenbildning i njurarna.

Flera njurgranuler som upptäckts i föreliggande studie finns i intracellulära eller extracellulära vesiklar (fig. 4H, I) och dessa liknar de matrisvesiklar som visat sig inducera förkalkning i ben och tänder7,8. Vi observerade nyligen att vesiklar isolerade från mänskligt och djurserum inducerar bildandet av mineral-NP: er och mikroskopiska fällningar in vitro25. Schlieper et al.34 observerade också att mineralpartiklar som finns i artärer är associerade med membranstrukturer och föreslog att matrisvesiklar eller apoptotiska kroppar kan representera kärnbildare av mineralpartiklar i dessa vävnader. På liknande sätt har Khan et al. rapporterade att kalciumfosfatavlagringar som finns i njurarna hos mänskliga patienter med idiopatiska njursten är associerade med kollagenfibrer och matrisvesiklar9. Dessa resultat tyder på att de mineralo-organiska NP som detekteras i njurvävnad kan bildas via en mekanism som involverar membranvesiklar, en situation som är analog med vad som ses i aterosklerotiska artärer7,8. Å andra sidan visade en nyligen genomförd studie att ektopisk förkalkning som hittats i kvinnors bröstartärer inte var associerad med osteogena eller apoptotiska cellmarkörer43, vilket tyder på att mekanismen för förkalkning kan vara specifik för organet eller det biologiska sammanhanget som är involverat. Dessutom kan mineraloorganiska NP:er såsom de som beskrivs häri mänskliga njurvävnader också bildas på grund av misslyckande att upprätthålla fysiologiska koncentrationer av joner (t.ex. kalcium och fosfat) och förkalkningshämmare (t.ex. albumin, fetuin-A och apo) -A1) i människans kroppsvätskor.

Våra resultat tyder på att det elektrontäta lagret och kärnan av mineral-organiska NP: er kan innehålla högre nivåer av proteiner och organiska molekyler jämfört med de elektronlucenta områdena av partiklarna (Fig. 6A, B). Dessa elektrontäta lager verkar vara mineraliserade, vilket framgår av den kristallina naturen hos detta material under TEM (se fig. 4A–J). Andra författare, inklusive Ryall41 och Evan et al.44, har föreslagit att det elektronlucenta lagret kan representera mineraler medan elektrontäta lager kan motsvara organiska molekyler. Dessa tolkningar kan åtminstone delvis bero på det sätt på vilket proverna bearbetades och undersöktes i varje studie samt arten av de utgångsvävnader som användes.

Förutom att spela en roll i ektopisk förkalkning, kan mineral-organiska partiklar inducera inflammation i njurvävnad. Vi har nyligen visat att medan mineralo-organiska NP inte lyckas inducera utsöndringen av pro-inflammatoriskt interleukin-1 av mänskliga makrofager, kan mineralaggregat större än 1 μm göra det23. Frisättningen av interleukin-1 som svar på kristallina material har visat sig vara beroende av aktiveringen av intracellulära molekylära komplex som kallas inflammasomerna45–47. Dessutom upptäcktes mineralpartiklarna i njurar med tumörer och sambandet mellan cancer och inflammation är nu välkänt48. Möjligheten att aggregerade mineralpartiklar kan aktivera en inflammasom och bidra till utvecklingen av inflammation och cancer i njurar eller andra vävnader återstår att undersöka.

Förutom ektopisk förkalkning kan mineralgranulerna som beskrivs här delta i andra sjukdomsprocesser. Till exempel har vi tidigare föreslagit att mineral-NP:er kan binda till olika proteiner i kroppsvätskor och tömma dessa organiska molekyler från kroppsvätskor20,26. Å andra sidan kan människokroppen förhindra bildning och ackumulering av mineral-NP under normala omständigheter genom att förlita sig på närvaron av förkalkningshämmare och det retikuloendoteliala systemet (dvs. makrofager). Mineral-NP:er kan alltså ackumuleras endast när systemisk eller lokal kalciumhomeostas störs och när skyddsmekanismerna har misslyckats i människokroppen.

Vi föreslår att nanomaterialmetoden som utvecklats här kan användas för att studera bildningen av mineraloorganiska NP i djur- och mänskliga vävnader. Till exempel kan antikroppar framtagna mot förkalkningshämmande proteiner såsom albumin, fetuin-A och apo-A1 användas i kombination med mineralanalys för att detektera och karakterisera bildningen av mineralo-organiska NPs i vävnaderna i djurmodeller. Resultaten som erhålls med detta tillvägagångssätt kan tillämpas på kliniska mätningar gjorda på mänskliga kroppsvätskor för att identifiera biologiska parametrar som återspeglar tillståndet för mineralpartikelbildning och ektopisk förkalkning i kroppen. Vi förväntar oss att denna kunskap kan leda till utvecklingen av nya terapeutiska strategier för att förebygga och behandla mänskliga sjukdomar och tillstånd associerade med ektopisk förkalkning.

Metoder

Njurvävnad.Användningen av mänskliga vävnader och experimenten som utfördes i denna studie godkändes av Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital; metoderna och experimenten utfördes i enlighet med godkända riktlinjer. Skriftligt informerat samtycke erhölls från patienterna. Kontrollfriska njurvävnader erhölls från biopsier av trauma- och hematompatienter utan njursjukdom (n=2); njurvävnad erhölls också från njurcancerpatienter (n=20) och från patienter med njursjukdom i slutstadiet (n=2) vars njurar togs bort eller biopsierades under transplantationskirurgi (tabell 1). För njurcancervävnader dissekerades den icke-cancerösa delen av vävnaden och analyserades i föreliggande studie.

Histologisk analys.Njurvävnad monterades på paraffinblock. Blocken sektionerades och vävnadsskivor upphettades på en varm platta vid 70 grader i 30 minuter för att avlägsna paraffin. Sektionerna nedsänktes i en ny lösning av xylen tre gånger under 15 minuter för att fullständigt avlägsna det återstående paraffinet. Sektionerna rehydrerades med 95 procent, 80 procent och 70 procent etanol i 5 minuter varje gång. Rehydratiserade prover tvättades med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) i 5 minuter. Cellkärnor färgades med hematoxylin under 8 min. Färgen avlägsnades från proverna med varmt vatten i 10 min. Njurprover sköljdes i ddH2O och doppades 10 gånger i 95 procent etanol. De etanolbehandlade proverna motfärgades med eosin Y under 1 min. Proverna dehydratiserades med 95 procent och 100 procent etanol i 10 minuter varje gång, följt av ett dehydratiseringssteg i xylen i 10 minuter. De slutliga uttorkade njurproverna monterades på objektglas med 50 procent glycerol och observerades under ett ljusmikroskop utrustat med en digitalkamera.

Avparaffiniserade och rehydrerade prover preparerades enligt beskrivningen för H&E-färgning. Rehydratiserade sektioner färgades med silvernitrat (5 procent), följt av exponering för UV-ljus i 20 minuter. Lösningen tvättades med ddH2O i 15 min. Sektionerna färgades med natriumtiosulfat (5 procent) under 5 minuter, följt av tvättning med ddH2O i 15 minuter. Sektionerna färgades med nukleärt snabbt rött (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) under 5 min. Färgade prover dehydratiserades successivt med 95 procent och 100 procent etanol i 10 minuter vardera, före dehydrering i xylen i 10 minuter. Njurprover monterades på objektglas och undersöktes enligt beskrivningen ovan.

Elektronmikroskopi och EDX-analys.Njurprover skars i små bitar mindre än 1 mm tjocka med användning av ett LGPS-dissektionsmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Vävnaderna fixerades med 2,5 procent glutaraldehyd och 1 procent paraformaldehyd i 0,1 M kakodylatbuffert vid 4 grader över natten. Fasta prover tvättades tre gånger med 0.1 M kakodylatbuffert i 8 procent sackaros (pH 7,2) på is under 10 minuter. Tvättade vävnader inkuberades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HP04) innehållande 1 procent osmiumtetroxid och 1,5 procent kaliumferrocyanid under 2 timmar på is. Vävnaderna tvättades med ddH2O på is 10 min tre gånger. Tvättade vävnader färgades på is med 1 procent uranylacetat i ddH2O under 1 timme, innan de tvättades tre gånger med ddH2O på is. Njurvävnad dehydrerades med 30, 50, 70, 80 och 90 procent etanol i 10 minuter varje gång, förutom när etanolen nådde 70 procent, i vilket fall proverna förvarades vid 4 grader över natten. Vävnader färgades med 1 procent fosfovolframsyra i 95 procent etanol under 15 minuter, före dehydrering med 95 procent etanol i 5 minuter. Proverna nedsänktes i propylenoxid vid 40, 57, 67 och 100 procent i etanol under 10 minuter varje gång, följt av ytterligare en nedsänkning i 100 procent propylenoxid i 5 minuter. Njurvävnader infiltrerades med 50, 70 och 100 procent Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) under 1 timme varje gång. Eponat 812-inbäddade njurprover preparerades genom att inkubera två gånger i 100 procent Eponate. Inbäddade prover inkuberades i en ugn vid 60 grader över natten för att tillåta hartspolymerisation.

Tvättade HS-NP-pellets erhållna enligt ovan fixerades med glutaraldehyd (2,5 procent) och paraformaldehyd (1 procent) i ddH2O under 4 timmar vid 4 grader. Fasta pellets tvättades med ddH2O tre gånger under 10 minuter varje gång. Pellets dehydrerades med successiva inkubationer i 30, 50, 70, 80, 90, 95 och 100 procent etanol, under 10 minuter varje gång, förutom när etanolen nådde 70 procent, där pelletsen förvarades vid 4 grader över natten. Andra etanollösningar sattes endast i kontakt med pellets under 10 min. Dehydrerade pellets infiltrerades med LR vitt inbäddningsmedium (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) med olika förhållanden av etanol och LR-medium (3:1, 1:1 och 1:3) under 30 minuter vardera. Pelletarna infiltrerades med färskt LR-medium (100 procent) över natten före polymerisation. Pellets infiltrerade med LR-medium inkuberades i en ugn vid 60 grader under 2 dagar för att tillåta hartspolymerisation. Block av njure och HS-NP: er sektionerades för att producera skivor med en tjocklek på 70–100 nm med hjälp av en Reichert Ultracut S mikrotom (Leica, Wetzlar, Tyskland). Vävnadssektioner färgades med 4 procent uranylacetat före visualisering under ett JEM 1230 transmissionselektronmikroskop (JEOL, Tokyo, Japan) arbetat vid 100 kV. Elektrondiffraktionsmönster erhölls med användning av samma system. Nickelgaller användes som stöd.

För EDX-analys färgades tunna sektioner av njurvävnad med uranylacetat och tvättades med ddH2O enligt ovan, följt av torkning i ett elektroniskt exsickatorskåp. Prover observerades under ett högupplöst JEM 2100 transmissionselektronmikroskop (JEOL) arbetat vid 120 kV. EDX-spektra erhölls i tre exemplar med användning av ett INCA Energy EDS-system (Oxford Instruments, Abingdon, Storbritannien). Tunna sektioner av HS-NPs observerades utan färgning.

Framställning av mineralo-organiska NP.Alla utgångslösningar justerades till pH 7,4 och steriliserades genom filtrering genom 0.2μm membran före användning. HS erhölls från friska frivilliga försökspersoner med användning av en konventionell venpunktionsteknik. Användningen av mänskliga biologiska vätskor i denna studie godkändes av Institutional Review Board vid Linko Chang Gung Memorial Hospital och skriftligt informerat samtycke erhölls från frivilliga. HS-NP framställdes genom att tillsätta 3 mM CaCl2 och Na2HPO4 vardera i DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) innehållande 10 procent HS, följt av inkubation under en vecka i cellodlingsförhållanden (37 grader, 5 procent CO2, fuktad luft). Partiklarna pelleterades genom centrifugering vid 16, 000 xg i 15 minuter vid 4 grader och tvättades två gånger med HEPES-buffert (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) med användning av samma centrifugeringsförfarande.

SDS-PAGE och Western blotting.SDS-PAGE och Western blot-analys utfördes väsentligen som tidigare15. Kortfattat, 0,2 ug (Fig. 5A,D) eller 1,2 ug (Fig. 5B,C) HS-proteiner, 47 ug (Fig. 5A,B,D) eller 590ug av HS-NP-proteiner (fig. 5C), 0.1 ug HSA (fig. 5A–D) och 0.6 ug (fig. 5A, C, D) eller {{23} },15 ug HSF (Fig. 5B) löstes i 5x "laddningsbuffert" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 procent SDS, 0,05 procent bromfenolblått, 50 procent glycerol, 12,5 procent - merkaptoetanol) till en slutlig koncentration av 1 x , före upphettning vid 95 grader i 5 minuter och separation under denaturerande och reducerande förhållanden på en 10 % SDS-PAGE med användning av ett minigelsystem (Hoefer, Holliston, MA). NP-kontrollen (används i spår 1 i Fig. 5A–D) bestod av mineral-NP:er framställda genom att tillsätta 3 mM CaCl2 och Na2HPO4 vardera i DMEM (slutlig volym på 1 ml), följt av inkubation under en dag i cellodlingsförhållanden; partiklarna pelleterades genom centrifugering vid 16, 000 xg under 15 minuter, tvättades två gånger med HEPES-buffert och återsuspenderades i 50 ul HEPES-buffert. En alikvot av 20 ul resuspenderade partiklar bearbetades för SDS-PAGE enligt ovan. PVDF-membran blockerades under 1 timme i 5 procent (vikt/volym) avfettad mjölk vid rumstemperatur. De primära antikroppar som genererats internt enligt beskrivningen tidigare25 användes i en spädning av 1:1,000 (-apo-A1 och -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , eller 1:6,000 ( -HSA). Get-anti-kanin pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppen användes baserat på instruktionerna tillhandahållna av tillverkaren (Millipore, Billerica, MA). Blotterna avslöjades med användning av förstärkt kemiluminescens (Amersham Biosciences, Amersham, Storbritannien) och autoradiografiska filmer.

Immunogold-märkning.Prover preparerades för TEM-observation. HS-NP-block sektionerades i skivor mindre än 7 0 nm tjocka. Provsektioner på galler blockerades med 1 procent fiskgelatin (Sigma) i 0,1 M HEPES-buffert (pH 8,0) under 25 minuter. Gallren inkuberades med följande primära antikroppar: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-Al, 1:30; -HS-NP, 1:60. Den negativa kontrollen innehöll ingen primär antikropp (1 procent fiskgelatin i HEPES-buffert). De inkuberade sektionerna sköljdes med HEPES-buffert under 15 min. Sköljda sektioner blockerades med 1 procent fiskgelatin i HEPES-buffert under 20 min. Proverna behandlades med det sekundära 5-nm-guld-konjugat get-anti-kanin-IgG under 1 timme. Proverna tvättades med HEPES-buffert i 10 minuter, innan de tvättades med ddH2O i 10 minuter. TEM-observationer utfördes enligt ovan.

Fluorescensmikroskopi.Histologiska njurvävnadsglas framställda enligt ovan blockerades med 1 procent bovint serumalbumin under 1 timme vid rumstemperatur. Objektglasen inkuberades med primära polyklonala antikroppar i en utspädning av 1:4,000. Efter tvättstegen inkuberades proverna med de sekundära antikropparna get anti-kanin-FITC (492/520 nm) och get anti-kanin-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) vid 1:100 för 1h. Komplexen tvättades med PBST under 15 min. Den fluorescerande färgen 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) användes vid 10 ug/ml under 15 minuter. DAPI-färgade prover dehydratiserades med 95 och 100 procent etanol i 10 minuter vardera, följt av dehydrering i xylen i ytterligare 10 minuter. Dehydrerade njurprover monterades med Vectashield fluorescence H-1000 monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) och observerades under ett konfokalmikroskop (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Tyskland) utrustad med en Spot Flex-kamera.

Cistanche tubulosa förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

Referenser

1. Giachelli, CM Ektopisk förkalkning: insamling av hårda fakta om mineralisering av mjukvävnad. Am J Pathol 154, 671-675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vaskulär förkalkning: mekanismer och kliniska följder. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161-1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Calcification in aterosclerosis. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Mönster och riskfaktorer för systemisk förkalkad ateroskleros. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331-336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Brister på kalciumreglerande proteiner hos dialyspatienter: ett nytt koncept för kardiovaskulär förkalkning i uremi. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Inriktning på vaskulär förkalkning: mjukgör upp ett hårt mål. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Kalciumreglering av vaskulära glatta muskelceller härledda matrisvesiklar. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Förkalkning vid åderförkalkning: benbiologi och kronisk inflammation vid artärkorsningen. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Association of Randalls plack med kollagenfibrer och membranvesiklar. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biokemisk karakterisering av serumfetuin-mineralkomplexet. J Biol Chem 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Serumnivåer av fetuin-mineralkomplexet korrelerar med artärförkalkning hos råtta. J Biol Chem 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Hierarkisk roll för fetuin-A och sura serumproteiner i bildandet och stabiliseringen av kalciumfosfatpartiklar. J Biol Chem 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Nanoanalytisk elektronmikroskopi avslöjar grundläggande insikter i mänsklig kardiovaskulär vävnadsförkalkning. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Påstådda nanobakterier i mänskligt blod som kalciumkarbonat-nanopartiklar. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Förmodade nanobakterier representerar fysiologiska rester och odlingsbiprodukter av normal kalciumhomeostas. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Karakterisering av granuleringar av kalcium och apatit i serum som pleomorfa mineraloproteinkomplex och som prekursorer till förmodade nanobakterier. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineralkomplex som liknar serumkalciumgranuler och förmodade nanobakterier: demonstration av ett koncept med dubbel hämning-sådd. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Nanobakteriers uppgång och fall. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kritisk utvärdering av gamma-bestrålat serum som används som matare i odling och demonstration av förmodade nanobakterier och förkalkande nanopartiklar. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Omfattande proteomisk analys av mineralnanopartiklar härledda från mänskliga kroppsvätskor och analyserade med vätskekromatografi-tandem masspektrometri. Anal Biochem 418, 111-125 (2011).