Utvärdering av tarmtransporten av ett fenyletanoid-glykosidrikt extrakt från Cistanche Deserticola över Caco-2-cellmonolagermodellen

Introduktion

Caco-2-cellinjen, som härrörde från humana kolonadenokarcinom, uppvisar enterocytliknande egenskaper. Under normala förhållanden differentierar Caco-2-celler sig spontant från mogna celler och bildar intakta monolager. De intilliggande cellerna fäster via täta förbindelser bildade på den apikala sidan av monoskiktet, vilket kan särskilja passivtoch aktivt transporterade läkemedel över epitelskiktet. På grund av den morfologiska och biokemiska likheten med normala enterocyter, fungerar Caco-2-cellmonoskikt som en väl accepterad in vitro-modell för studier av tarmens absorptionspotential och transportegenskaper hos läkemedel.

Till skillnad från kemikalier är växtextrakt (PE) blandningar vars biologiska aktivitet och aktiva beståndsdelar ofta inte är väl identifierade. Dessutom är tarmtransportegenskaperna hos PE, i motsats till egenskaperna hos dess beståndsdelar, nära relaterade till klinisk användning. Fluxmätningar för ett testprov över ett Caco-2-cellmonoskikt involverar vanligtvis kemiska metoder, såsom HPLC, LC/MS, etc. Även om dessa metoder är kraftfulla verktyg är de komplexa, tidskrävande, dyra och ibland kräver sofistikerad utrustning. Ännu viktigare är att varken en enskild eller en minoritetskomponent kan återspegla PE som helhet. Ett nytt tillvägagångssätt oberoende av bestämning av beståndsdelar måste därför etableras för att identifiera och utvärdera PE:s transportegenskaper.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), en holoparasitisk växt, är en vanlig traditionell kinesisk medicin som huvudsakligen används för att behandla njurbrist, kroppssvaghet och förstoppning, och dessa användningar har officiellt registrerats i den kinesiska farmakopén.Fenyletanoidglykosider (PhG), inklusive echinakosid (EC), acteosid (AC) och isoacteosid (IS), etc., är en klass av polyfenoliska föreningar. De anses vara en av de viktigaste bioaktiva beståndsdelarna i Cistanche-arter. Farmakologiska studier har visat att bioaktiviteten hos PhG är mångsidig och inkluderar antioxidativa, anti-trötthet, leverskyddande, immunmodulerande, antiinflammatoriska och neuroprotektiva effekter. PhGs tarmtransportegenskaper har dock inte undersökts. I den här studien undersökte vi den intestinala permeabiliteten för ett PhG-rikt extrakt (PRE) från CD som ett integrerat system och permeabiliteten för tre stora PhG (AC, IS och EC) i differentierade Caco-2-celler. Våra resultat indikerade att PRE främst transporteras via dåligt absorberad passiv diffusion nedför en koncentrationsgradient utan efflux, vilket ger den farmakokinetiska basen för den kliniska tillämpningen av PhGs i CD.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Material och metoder

Material

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98 %) köptes från Must Biotechnology Co. (Chengdu, Kina). Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), fetalt bovint serum (FBS) och icke-essentiella aminosyror (NEAA) producerades av Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-brunns TranswellTM-plattor (insert membrantillväxtarea 4,67 cm2) erhölls från Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Råttsvanskollagen erhölls från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alla reagenser och kemikalier för HPLC-analysen var av analytisk kvalitet.

Förberedelse av PRE från CD

Det lufttorkade CD-materialet pulveriserades och extraherades genom perkolering med 70 % etanol. Den PhG-rika fraktionen framställdes såsom tidigare beskrivits och extraherades med vattenmättad n-butylalkohol. Extraktluten koncentrerades och torkades under reducerat tryck. Makroporös harts-UV-spektrofotometri mätte en PhG-halt på 78,4%. Det slutliga provet representerade ett utbyte av 1,75 % råmaterial i torrvikt. Det erhållna provet förvarades vid -20 grader tills vidare användning.

Bestämning av AC, IS och EC med HPLC

Ett Shimadzu HPLC-system utrustat med mjukvara för LC-lösning användes för att analysera innehållet av AC, IS och EC i PRE. En omvänd fas Intersil C18-kolonn (4,6 mm × 25 0 mm, 5 μm) användes och hölls vid rumstemperatur. De mobila faserna var acetonitril och vatten innehållande 0,1 % fosforsyra (v/v) med gradienteluering (tabell 1) vid en flödeshastighet av 1,0 ml/min. UV-spektrofotometerdetektorn var inställd på 334 nm. För att exakt bestämma flödet av AC och IS utvecklade vi en ny metod för HPLC-fluorescensdetektion (HPLC-FLD). Efter en strukturell analys och fluorescensvåglängdsskanning (data visas inte) erhöll vi de optimala fluorescensdetektionsförhållandena för AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) och IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm).

HPLC-analysmetoden validerades med hjälp av följande prestandaegenskaper: stabilitet, linjäritet, känslighet, precision (variabilitet inom och mellan dagar) och noggrannhet. Analyterna i transportbufferten förvarades vid 25 grader i mörker under 24 timmar och deras stabilitet mättes. Analyterna var mycket stabila i närvaro av vitamin C (0,4 %) eftersom de relativa standardavvikelsen (RSD)-värdena i toppområdena var < 3,5 %. Den linjära regressionsekvationen, korrelationskoefficienten, linjäritetsområde, LOD och LOQ för AC, IS och EC visas i tabell 2. LOD (18–30 nM) och LOQ (60–100 nM) värden illustrerar att HPLC-FLD- och HPLC-UV-metoderna är mycket känsliga. RSD-värdena som uttrycker metodens precision var alla < 2 % för variabilitet inom och mellan dagar, vilket tyder på god precision. För utvärdering av återvinning tillsattes AC, IS och EC till transportbufferten för att ge tre (höga, medelhöga och låga) koncentrationsnivåer. Återvinningsvärdena för metoden för analyterna är sammanfattade i tabell 3. De genomsnittliga återvinningarna varierade från 90,0 % till 96,4 %, vilket indikerar god noggrannhet. Sammanfattningsvis är de etablerade HPLC-metoderna tillfredsställande vad gäller linjäritet, känslighet, precision och noggrannhet för kvantifiering av AC, IS och EC i transportbuffert.

Bestämning av PRE genom bioanalyssystem

Bioanalysen (total antioxidativ kapacitet) baserades på FRAP-analysen (ferric reducing/antioxidant power) som vi tidigare beskrivit [16] och validerades i termer av linjäritet och precision (variabilitet inom och mellan dagar). Linjäriteten för bioanalysmetoden bestämdes baserat på kalibreringskurvorna. Koncentrationsintervallet för linjäritet var 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Precisionen för den etablerade bioassaymetoden bestämdes i termer av variabiliteten inom och mellan dagar för en analys av PRE (10,0 ug/ml). Metodens repeterbarhet under dagen bestämdes baserat på fem på varandra följande bestämningar på samma dag. Repeterbarheten mellan dagar mättes baserat på fem på varandra följande bestämningar på tre olika dagar. RSD-värdena för metodens precision var 1,014 % och 4,72 % för variabilitet inom respektive dag, vilket indikerar god precision. Den etablerade bioassaymetoden är således tillfredsställande vad gäller linjäritet, precision och noggrannhet för kvantifiering av PRE i en transportbuffert.

Cell kultur

Caco{0}}-celler odlades vid 37 grader och 95 % relativ fuktighet i en atmosfär innehållande 5 % CO2 och ett medium bestående av DMEM, 10 % FBS, 1 % NEAA, 1 % L-glutamin, penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 ug/ml). Mediet byttes varannan dag under celltillväxt och differentiering. Cellerna odlades i 75-cm2 plastflaskor och skördades var 3-5 dag med 0,05 % EDTA-trypsin. För transportexperimenten såddes cellerna med en densitet av 1×105 celler/cm2 på Transwell-inlägg belagda med kollagen. Ungefär 21 dagar efter sådd användes monoskikten för transportexperimenten. Deras integritet bestämdes genom att mäta det transepiteliala elektriska motståndet (TEER) över monoskikten med en EVOM utrustad med ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). TEER-värdena för Caco-2-cellmonoskiktet behövde överstiga 500 O∙cm2.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR LÖDANDE OCH LAXERANDE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Transportexperiment

Monoskiktet tvättades med transportbuffert (P-buffert innehållande 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM glukos, 3 mM CaCl2 och 145 mM NaCl, pH 7,4) och förinkuberades sedan i 20 min. vid 37 grader. Efter avlägsnande av transportbufferten sattes färsk transportbuffert innehållande testprover till den apikala (AP) kammaren (1,5 ml) i AP till basolaterala (BL) riktningsstudier eller BL-kammaren (2,5 ml) i BL till AP riktningsstudier. För AC-, IS- och EC-analyser med användning av HPLC avlägsnades en alikvot (300 ul) från varje mottagarkammare vid olika tidsintervall (30, 60, 90 och 120 min). Mottagningskammaren fylldes på med samma volym färsk förvärmd (37 grader) transportbuffert efter varje provtagning. De insamlade proverna förvarades vid -20 grader för vidare användning. För PRE-bestämning med bioassay togs endast proverna efter 120 min. På grund av instabiliteten hos PRE, AC, IS och EC tillsattes 0,4 % (vikt/volym) vitamin C för att stabilisera proverna för att bestämma AC-, IS- och EC-halterna med HPLC, och proverna för PRE-bioanalysen var analyseras omedelbart efter provtagning. Den skenbara permeabilitetskoefficienten (Papp eller 'Papp) värde för varje prov beräknades.

Dataanalys

Papp-värdena i AP BL- eller BLAP-riktningarna för AC, IS och EC beräknades baserat på följande ekvation: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), där Papp är den skenbara permeabilitetskoefficienten (cm/s) bestämd med HPLC. (4Q/4t) är graden av utseende av testföreningen (AC, IS eller EC) på mottagarsidan (μmol/s); A är skärets yta (cm2); CO är den initiala testföreningskoncentrationen på givarsidan (μmol/ml). Specifikt användes massenheten "ug" istället för "μmol" när 'Papp-värdena beräknades. Data uttrycks som medel ± SD.

Resultat

Sammansättning av AC, IS och EC i PRE från CD

Eftersom AC, IS och EC anses vara de viktigaste bioaktivaPhGs av Cistanche-arter, analyserade vi deras innehåll i PRE via HPLC-UV. Det representativa kromatogrammet visas i fig. 1. Identifieringen av dessa beståndsdelar baserades på jämförelse av retentionstiderna och UV-spektrumet med de för autentiska standarder vid en våglängd av 334 nm. Halten av AC, IS och EC i PRE var 26,60 %, 1,84 % respektive 32,83 %. Dessa tre föreningar står således för 61,27 % av PRE; dessutom indikerar ovanstående resultat att PhG-halten i PRE är 78,4%. Därför står AC, IS och EC för cirka 80% av PhGs i PRE.

Total antioxidativ kapacitet av PRE, AC, IS och EC

Studier avantioxidativ aktivitet hos PhGfrån CD har rapporterats, och AC, IS och EC står för cirka 80 % av PhGs i PRE. Således analyserades den totala antioxidativa kapaciteten hos PRE, AC, IS och EC och uttrycktes med hjälp av FRAP-värdena (× 10–6 mmol). Som visas i Fig. 2, när FRAP-värdet var 8 × 10–6 mmol, var slutkoncentrationerna av PRE, AC, IS och EC 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml och 4,89 ug /ml, respektive, vilket indikerar att den totala antioxidativa kapaciteten för dessa fyra prover rankades enligt följande: AC > EC > PRE > IS. Bioaktiviteten hos PRE tillskrivs dess aktiva ingrediensgrupper (AIG). För cirka 60 % av PRE, visade AC och EC starkare total antioxidativ aktivitet än PRE och IS. Eftersom IS (1,84%) utgör en mycket liten del av PRE, är andra komponenter, såsom den svagt antioxidativa IS, också tydligt aktiva i PRE. Överraskande nog skilde sig den totala antioxidativa aktiviteten nästan 7-faldigt mellan AC och dess isomer IS, vilket indikerar att inte bara antalet fenoliska hydroxylgrupper utan även placeringen av fenoliska hydroxylgrupper i molekylen påverkade den antioxidativa effekten .

Validering av Caco-2 monolager

För att validera Caco-2-cellmonolagersystemet, var Papp-värdena för propranolol (en vältransporterad markör) och Lucifer gul (en dåligt transporterad markör) från AP till BL över Caco-2-monoskikten bestäms till 1,51 × 10–5 cm/s respektive 2,8 × 10–7 cm/s, och dessa värden överensstämde med de som publicerats i tidigare rapporter. Analysen av alkaliskt fosfatasaktivitet bekräftade också att Caco-2-cellmonoskikten var kvalitativt jämförbara med tunntarmsepitelet.

Permeabiliteten för AC, IS och EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), medan de för dåligt absorberade läkemedel var låga (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Permeabiliteten för PRE

Ovanstående resultat indikerar att den totala antioxidativa kapaciteten hos PRE åtminstone beror på 61,27 % av AIG från PRE. Sålunda utvärderade vi TR för PRE baserat på dess koncentration-effektkurva för total antioxidativ kapacitet och beräknade 'Papp-värdena för att återspegla transportegenskaperna för PRE. 'Papp-värdena för PRE för AP!BL och BL!AP var (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s och (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, vilket indikerar att denna förening var dåligt permeabel. Vidare var utflöde eller aktiv transport inte uppenbart eftersom förhållandet mellan 'Papp BL till AP / 'Papp AP till BL för PRE var 1,45. Dessutom ökade den dubbelriktade TR för PRE linjärt mellan cirka 300 och 900 ug/ml (Fig. 5). Avsaknaden av riktningspreferens av resultaten tyder på att passiv diffusion är den huvudsakliga transportmekanismen för PRE.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA IMMUNITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussion

Jämfört med högrenade läkemedelsprodukter är PE i allmänhet blandningar som består av hundratals beståndsdelar med vitt skilda fysiokemiska egenskaper. Därför utövar PE systematisk, multitarget och flerkanals synergistisk verkan på grund av deras komplexa AIG [21], vilket hindrar analysen av PEs transportegenskaper. För att utvärdera transportegenskaperna hos PE mer vetenskapligt har vissa forskare identifierat flera komponenter, snarare än en enda komponent, i PE [22–24]. Ändå kan ett begränsat antal beståndsdelar inte spegla PE som helhet. Det är dock omöjligt att bestämma alla komponenter i PE. Dessutom, om olika komponenter i PE uppvisar helt olika transportegenskaper, kommer de holistiska transportegenskaperna hos PE vara svåra att identifiera.

På 1990-talet användes bioanalyssystem för att utvärdera TR av antimikrobiella medel [25]. År 2005 hade Eguchi och hans kollegor [26] utvärderat den antioxidativa aktiviteten hos morotsextrakt genom att använda BL-media från differentierade Caco-2-celler; detta tillvägagångssätt är mer lämpligt för att återspegla in vivo-situationer.

Baserat på en tidigare rapport om aktiviteten hos PhG och våra resultat (Fig. 2), kan TR för AIG i PRE utvärderas genom att bestämma den totala antioxidativa kapaciteten hos mediet i mottagarkammaren. Efter transportexperimenten fann vi att TR för PRE var liknande i båda riktningarna, och denna transport var omättad och dåligt absorberad ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), och det gjorde den inte indikerar efflux, vilket tyder på att passiv diffusion nedför en koncentrationsgradient är den huvudsakliga transportmekanismen för PRE (Fig. 5). Vidare överensstämmer transportegenskaperna för PRE med de för AC, IS och EC, de effektiva komponenterna som uppvisar antioxidativ aktivitet i PRE (Fig. 4 och Tabell 4). Detta resultat förväntades och indikerade att det nuvarande bioassaysystemet är lämpligt och tillförlitligt för utvärdering av transportegenskaperna för AIG i PRE i differentierade Caco-2-celler.

I motsats till det kanoniska Papp-värdet, som vanligtvis används för att spegla transporten av en enskild förening, kan 'Papp-värdet som erhålls från TR baserat på koncentration-effektkurvan inte bara återspegla de komponenter som penetrerar monolager med en intakt struktur utan involverar även andra faktorer relaterade till målaktiviteten, såsom komponenternas metaboliter, kemiskt nedbrutna produkter och till och med vissa cytokiner som utsöndras från Caco-2-celler som svar på stimulering som kan påverka målbioaktiviteten. Multifaktorn som nämns ovan, snarare än bara de transporterade intakta komponenterna, bestämmer alltså 'Papp-värdet. Därför kan 'Papp korrelera starkare med in vivo-situationer än det kanoniska Papp-värdet. I denna studie klargjorde vi den passivt diffusa och dåligt absorberade naturen hos PRE baserat på dess 'Papp-värde, och denna natur kan vara relaterad till den höga dosen och långa kliniska behandlingsperioden för CD. Icke desto mindre kommer dessa fynd att ge mer systematisk vägledning för kliniker i tillämpningen av CD när endast transportegenskaperna för de flesta AIG i CD, inte bara PhGs, har identifierats.

Det valda bioaktivitetsobjektet måste dock vara tillräckligt känsligt för att kunna detekteras i mediet i mottagarkammaren, vilket utgör en utmaning för upprättandet av ett bioanalyssystem för att utvärdera transportegenskaperna hos PE. Dessutom bör bioaktiviteten också bero på så många komponenter som möjligt. I vår studie var analysen av den totala antioxidativa kapaciteten mer lämplig än flera andra metoder (S1 Fig.). Men trots det kan vår analys bara detektera TR för PRE vid 120 min.

Tillsammans etablerade den här studien ett nytt bioanalyssystem för att utvärdera tarmpermeabiliteten för PRE i differentierade Caco-2-celler. De erhållna resultaten visade att en dåligt absorberad passiv diffusion nedför en koncentrationsgradient utan utflöde är den huvudsakliga transportmekanismen för PRE (Fig. 5), vilket ger den farmakokinetiska basen för den kliniska tillämpningen av PhGs i CD. Det är möjligt att använda ett nytt bioassaysystem för att utvärdera TR och därigenom beräkna 'Papp-värdena för att bedöma tarmtransportegenskapen hos AIG i PE. Detta tillvägagångssätt kan också vara lämpligt för andra PE givet lämplig bioaktivitet.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%