Experiment 3 Effekt av Cistanche Deserticola Phenylethanol Glycoside på Råtta Perimenopausal modell Ⅲ

Experiment 3 Effekt av Cistanche deserticola fenyletanolglykosid på perimenopausal råttamodell

1 Experimentellt material

1.1 Försöksdjur

Wistar-råttor, SPF-klass, honor, tillhandahållna av Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., råttcertifikatnummer för denna batch: 0017216; laboratoriecertifikat nummer SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Experimentella läkemedel

Cistanche deserticola fenyletanolglykosidframställdes enligt metoden i experiment 1, och innehållet nådde 66,47%. Gengnian'an Kapsel, ingredienser: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, pionbark, Poria cocos, pärlemor, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum vinstockar, polygonum multiflorum, floating Unflorum vine . Funktioner och indikationer:Ge näring till yin och dämpa yang, lindra besväroch lugna sinnet. Används vid klimakteriets värmevallningar och svettning, yrsel, tinnitus, irritabilitet och sömnlöshet. Specifikationer: 0,3g per kapsel. Användning och dosering: Oral, 3 kapslar åt gången, 3 gånger om dagen. Tillverkare: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Produktionsbatchnummer: 121104. Godkännandenummer: National Drug Approval No. Z14021848.

Sojaisoflavoner och mjuka vitamin E kapslar, ingredienslista: sojaisoflavonpulver, vitamin E, solrosolja, gelatin, glycerin, vatten, tartrazin, titandioxid. Ikoniska ingredienser och innehåll: Varje 100g innehåller 55,2 mg sojaisoflavoner (beräknat som genistein) och 608,5 mg vitamin E. Hälsofunktioner: Öka bentätheten. Instruktioner och dosering: Ta 1 kapsel 2 gånger om dagen med varmt vatten. Specifikationer: 500mg×100 kapslar. Tillverkare: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Produktionssatsnummer: 13070302. Godkännandenummer: National Food Health G20080032.

HUR LÅNGE TAR DET FÖR CISTANCHE ATT ARBETA?

1.3 Experimentella reagenser

Karboximetylcellulosanatrium, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., batchnummer: 20120418; penicillinnatrium för injektion, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikation: 4 miljoner enheter, produktionssatsnummer: c1206807;

Formaldehydlösning (analytiskt ren), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., produktionssatsnummer: 20130902; 0,9% natriumkloridinjektion, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikation: 250ml, produktionsbatchnummer: 13082405B;

Klorhydrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, batchnummer 20120827; Rat E2 ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Rat T ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Rat LH ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Rat FSH ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A;

2 Experimentella metoder

2.1 Modellering och läkemedelsadministration

Modelleringsmetod: Ta 100 wistarråttor av honkön med en kroppsvikt på 210~230g, välj slumpmässigt 12 råttor som en tom grupp och genomgå en skenoperation, och de återstående råttorna kommer att användas för att skapa klimakteriet modeller. Efter att råttorna vägts, bedövades råttorna genom intraperitoneal injektion av 10 % kloralhydrat (0,3 ml/100 g) och bukpositionen fixerades. Sedan trimmades råttorna från under det sista revbenet på ryggen vid skärningspunkten mellan mittaxillärlinjen och cirka 2 cm från ryggradens laterala sida och desinficerades sedan. Hud- och ryggmusklerna är inskurna cirka 1 cm, och en mjölkvit glänsande fettmassa kan ses i synfältet av snittet, och äggstocken är inbäddad i den. Använd en liten pincett för att försiktigt ta tag i fettmassan och dra ut den ur snittet, separera fettmassan så ser du en grupp tunna, oregelbundna, gulröda äggstockar. När du skär, ligera först äggledaren (inklusive fett) under äggstocken med en tunn tråd, ta bort den vänstra äggstocken helt och ta bort 80 % av den högra äggstocken. Efter operationen sattes livmoderhornen tillbaka i bukhålan, muskler och hud suturerades och båda äggstockarna avlägsnades på samma sätt. Efter operationen uppfostrades djuren noggrant och injicerades intramuskulärt med 200,000 u/kg penicillin (0,1 ml vardera) för att förhindra infektion, en gång om dagen under 3 dagar i följd. 5 dagar efter operationen påbörjades vaginal utstryksundersökning av råttor en efter en, en gång om dagen under 5 dagar i följd. Råttor med östrosreaktioner i utstryket kasserades. 72 helt kastrerade råttor valdes ut och delades slumpmässigt in i 6 grupper. För experimentella ändamål är de modellgruppen, Gengnianan-gruppen, sojaisoflavongruppen och Cistanche deserticola-fenyletanolglykosidgruppen med stor, medelstor och liten dos.

Beredningsmetod: Beredningsmetod: {{0}},5 % CMC Beredningsmetod: Väg upp 4 g karboximetylcellulosanatrium och blanda det med destillerat vatten för att få 800ml. Doserna av stora, medelstora och små doser av Cistanche deserticola fenyletanolglykosidgrupp var 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg respektive 33,33 mg/kg (administrationsvolym 1 ml/100 g). Beredningsmetod: Väg 1333,3 mg, 666,7 mg respektive 333,3 mg totala hallonflavonoider, lös upp dem med en liten mängd 0,5 % CMC, justera sedan volymen till 100 ml, blanda väl, och det är allt. Gengniangan kapslar (450 mg/kg, blandat med destillerat vatten till 45 mg/ml, 1 ml/100 g, motsvarande 10 gånger den kliniska dosen); Beredningsmetod: Ta 15 Gengniangan-kapslar, lös dem först med en liten mängd 0,5 % CMC, justera sedan volymen till 100 ml och blanda väl, vilket är dosen Gengnianan Capsule Suspension (450mg/kg). Sojabönisoflavon Vitamin E mjuka kapslar (166,67 mg/kg, använd destillerat vatten för att göra 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, motsvarande 10 gånger den kliniska dosen); Beredningsmetod: Ta 4 Sojabönisoflavoner Vitamin E mjuka kapslar, lös först upp med en liten mängd 0,5 % CMC, justera sedan volymen till 120 ml och blanda väl för att erhålla dosen av sojaisoflavon vitamin E mjuk kapselsuspension (16,67 mg/kg) ).

Administreringsmetod: Djur i varje grupp fick motsvarande läkemedel den 10 dagen efter operationen. Blankgruppen och modellgruppen sondades med samma volym 0,5 % CMC-lösning (sondvolymen var 1 ml/100 g), och Gengnianan-gruppen gavs med Gengnianan kapselsuspension (450 mg/kg, motsvarande 10 gånger den kliniska dosen) ). ), fick sojabönisoflavongruppen oralt administrerad sojabönaisoflavon vitamin E mjuk kapselsuspension (166,67 mg/kg, motsvarande 10 gånger den kliniska dosen), och den stora, medelstora och lilla dosenCistanche deserticola fenyletanolglykosidgrupper administrerades oralt enligt gruppen. Stora, medelstora och små doser av Cistanche deserticola fenyletanolglykosid (doserna är 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg respektive 33,33 mg/kg, dosvolymen är 1 ml/100 g), administrerad en gång om dagen genom kontinuerlig intragastrisk administrering . medicin i 30 dagar.

2.2 Observationsobjekt och detektionsmetoder

De horisontella-vertikala rörelsepoängen för råttor i varje grupp mättes 29 dagar efter administrering. 2 timmar efter den sista magadministreringen (fastande i 15 timmar), ta bort ögongloberna för att samla blod, separera serum ochplasmaoch mäta innehållet av E2, T, LH, FSH, GnRH och BGP i serumet och innehållet av -EP i plasman; råttorna dissekerades. Ta bort bräss, mjälte, livmodern och de återstående 20 % av äggstocksvävnaden, väg deras våta vikt och beräkna organindex för bräss, mjälte och livmoder (organindex=organ våtvikt mg/råtta vikt g) , och ta sedan bort hjärnan. För hypotalamus och hypofys framställdes vävnadshomogenat från hypotalamus, hypofys och 1/2 av livmodern, och innehållet av östrogenreceptorer i hypotalamus, hypofys och livmodervävnadshomogenat och androgen. receptorhalten i de hypotalamiska vävnadshomogenaten bestämdes. Tymus, mjälte, livmodern och äggstocken fixerades i 10 % formaldehydlösning, inbäddades i paraffin, sektionerades och färgades med HE. Dehistomorfologiska förändringari varje grupp observerades under ett ljusmikroskop.

2.2.1 Öppet fält metodtest

Den experimentella enheten är en kubisk öppen låda med en höjd på 40 cm och en längd och bredd på 80 cm. De omgivande väggarna och botten är svarta. Botten består av 25 block med lika stor yta, dividerat med vita linjer. Under experimentet placerades råttan i fyrkanten i mitten av den öppna rutan, och det horisontella aktivitetspoänget för antalet block som råttan korsade på botten inom 5 minuter (rutor med alla fyra tassar inmatade kan räknas), och antalet gånger bakbenen stod upprätt (två framtassar var i luften). (eller klamrar sig fast vid en vägg) vertikal aktivitetspoäng. Avföringen måste avlägsnas helt efter varje experiment, och varje råtta mäts en gång 2 timmar efter administrering. Detta experiment utfördes i ett tyst rum.

2.2.2 Metod för bestämning av kit

Skaffa serumprover: Använd provrör som är fria från pyrogener och endotoxiner. Undvik cellstimulering under operationen. Efter att ha samlat in blodet, centrifugera det vid 3000 rpm i 10 minuter för att snabbt och försiktigt separera serum och röda blodkroppar. Skaffa plasmaprover: antikoagulerade med heparinantikoaguleringsrör. Centrifugera vid 3000 rpm i 30 minuter och ta supernatanten. Skaffa vävnadshomogenatprover: Tillsätt en lämplig mängd fysiologisk saltlösning till vävnaden och mosa den. Centrifugera vid 3000 rpm i 10 minuter och ta supernatanten.

Bestämningsmetoden för råtta (råtta) östradiol (E2) ELISA-kit är densamma som i experiment 2. Koncentrationerna av standarder (S0-S5) är 0, 4, 8, 16, 32 och 64 pmol/L.

Analysmetoden för råtta (råtta) testosteron (T) ELISA Kit är densamma som analysmetoden för Estradiol ELISA Kit. Koncentrationerna av standarder (S{{0}}S5) är {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 och 320 pg /ml. Bestämningsmetoden för luteiniserande hormon (LH) ELISA-detektionskit från råtta (råtta) är densamma som bestämningsmetoden för östradiol ELISA-detektionskit. Koncentrationerna av standarder (S0-S5) är 0, 3, 6, 12, 24 och 48 ml/ml. Analysmetoden för follikelstimulerande hormon (FSH) ELISA-kit från råtta (råtta) är densamma som analysmetoden för estradiol ELISA-kit. Koncentrationerna av standarder (S0-S5) är 0, 0,75, 1,5, 3, 6 och 12 IE/L. Bestämningsmetoden för ELISA-detektionskit för råtta (råtta) gonadotropin-frisättande hormon (GnRH) är densamma som bestämningsmetoden för östradiol ELISA-detektionskit. Koncentrationerna av standarder (S0-S5) är 0, 5, 10, 20, 40 och 80 mlU/ml.

Bestämningsmetoden för råtta (råtta) osteokalcin (BGP/OCN) ELISA-detektionskit är densamma som bestämningsmetoden för östradiol ELISA-detektionskit. Koncentrationerna av standarder (S{{0}}S5) är 0, 0.75, 1.5, 3, 6 och 12 ng/ml. Bestämningsmetoden för råtta (råtta) -endorfin (-EP) ELISA-detektionskit är densamma som bestämningsmetoden för östradiol ELISA-detektionskit. Koncentrationerna av standarder (S0-S5) är 0, 3, 6, 12, 24 och 48 pg/ml. Bestämningsmetoden för råtta (råtta) östrogenreceptor (ER) ELISA-detektionskit är densamma som bestämningsmetoden för östradiol ELISA-detektionskit. Koncentrationerna av standarder (S{{20}}S5) är 0, 4, 8, 16, 32 och 64 pg/ml. Bestämningsmetoden för råtta (råtta) androgenreceptor (AR) ELISA-detektionskit är densamma som bestämningsmetoden för östradiol ELISA-detektionskit. Koncentrationerna av standarder (S0-S5) är 0, 25, 50, 100, 200 och 400 pg/ml.

2.3 Statistiska bearbetningsmetoder

För dataanalys användes det medicinska statistikpaketet SPSS17.0 för statistisk bearbetning av data. Mätdata uttrycktes som medel ± standardavvikelse (-x±s). Envägsvariansanalys användes för jämförelse mellan grupper. LSD-metoden användes för att testa variansens homogenitet. , Games-Howell-testet användes för ojämna varianser, och Ridit-testet användes för betygsdata.

Det kan ses från tabell 11 och figur 14 att jämfört med den tomma gruppen minskade tymusindex, mjältindex och livmoderindex för råttorna i modellgruppen signifikant (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Effekter på blodets biokemiska indexnivåer i perimenopausala modellråttor

Serum-E2-, T-, LH-, FSH-, GnRH- och BGP-innehållet och plasma-EP-innehållet hos råttor i varje grupp visas i tabellerna 12~13 och figurerna 15~17.

Det kan ses från tabellerna 12~13 och figurerna 15~18 att jämfört med den blanka gruppen, var serum-E2- och T-nivåerna hos råttor i modellgruppen signifikant minskade (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabell 14 Effekt av Cistanche deserticola fenyletanolglykosid på serum-GnRH och plasma-EP-nivåer i perimenopausal råttamodell (-x±s)

Det kan ses från tabell 14 och figurer 19-20 att jämfört med blankgruppen ökade serum-GnRH-nivån hos råttor i modellgruppen signifikant och plasma-EP-nivån minskade signifikant (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Effekter på ER- och AR-innehåll i vävnader från perimenopausala modellråttor

Innehållet av ER och AR i relevanta vävnader från råttor i varje grupp visas i tabellerna 16~17 och figurerna 22~23.

Det kan ses från tabell 17 och figur 23 att jämfört med den tomma gruppen var AR-nivån i hypotalamus hos modellgruppen signifikant lägre (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Effekter på organvävnadsmorfologi hos perimenopausala modellråttor

De patologiska och histologiska observationsresultaten av livmodern, tymus och mjälte hos råttor i varje experimentgrupp är som följer. De patologiska bilderna visas i bilaga 1 för de patologiska bilderna av perimenopausala modellråttor.

5.1 Effekt på livmodervävnadsmorfologi hos perimenopausala modellråttor

Beroende på de varierande graderna av förändringar i endometrium, körtlar och myometrium hos råttorna i varje experimentgrupp användes semikvantitativa standarder för att dela upp den patologiska vävnadsmorfologin i fyra nivåer, och livmodern hos råttorna i varje experimentgrupp var mätt. Observationsresultaten visas i tabell 18.

"-" Endometriepitelceller, körtlar, myometrium och serosa är alla normala; "+" endometriepitelcellerna och körtlarna är atrofierade, och myometrium och serosa är normala; "++" endometriepitel Celler och körtlar är delvis atrofierade, muskellagret är lätt atrofierat och serosa är normalt; "+++" endometriepitelceller och körtlar är signifikant atrofierade och serosa är normal.

Efter Ridit-testet kan man se från tabell 18 att jämfört med den tomma gruppen visade livmodern hos råttor i modellgruppen signifikanta patologiska vävnadsskador (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Effekt på äggstocksvävnadsmorfologi hos perimenopausala modellråttor

Beroende på de varierande graderna av förändringar i folliklar, corpus luteum, granulosaceller och blodkärl i äggstockarna hos råttor i varje grupp av experiment användes semikvantitativa standarder för att dela upp den patologiska vävnadsmorfologin i fyra nivåer. Äggstockarna hos råttor i varje grupp av experiment mättes och observerades. Resultaten visas i tabell 19.

Tabell 19 Effekt av Cistanche deserticola fenyletanolglykosid på äggstockspatologiska förändringar hos perimenopausala modellråttor Enhet: endast

"-" kan visa växande folliklar, mogna folliklar och gulkropp på alla nivåer. Gulkroppen är välutvecklad, med många lager av granulosaceller, rik follikulär vätska och rika blodkärl; "+" kan visa växande folliklar, mogna folliklar och gulkropp, men antalet mogna folliklar och gulkropp är litet. , folliklarna är mindre och granulosacellerna är mindre skiktade; "++" kan visa mogna folliklar och gulkroppen, med mer gulkropp, färre granulosaceller och färre blodkärl; "+++" har inga folliklar, mer corpus luteum och äggstocken Atrofisk, avaskulär.

Efter Ridit-testet kan man se från tabell 19 att jämfört med den tomma gruppen visade äggstockarna hos modellgruppens råttor signifikanta patologiska vävnadsskador (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Effekter på tymus och mjältvävnadsmorfologi hos perimenopausala modellråttor

Använd en mikrometer och mät tjockleken på de tjockaste och smalaste delarna av tymisk cortex hos varje råtta i varje experimentgrupp för att få medelvärdet; Använd mikrometerns baslinje för att falla på mjältknölarna, mät tjockleken på mjältknölarna på båda sidor med den centrala artären som centrum och beräkna medelvärdet. De uppmätta resultaten visas i Tabell 20 och Figur 24.

Det kan ses från tabell 20 och figur 24 att jämfört med blankgruppen minskade tjockleken på tymus cortex och volymen av mjältknölar i modellgruppen signifikant (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).