Experiment 4 Effekt av Cistanche Deserticola Phenylethanol Glycoside på mus Perimenopausalt syndrom Depression Modellmaterial och metoder 1 Experimentmaterial

1.1 Försöksdjur

Möss av SPF-klass, Kunming-ras, honor, 18~22g, tillhandahållna av Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., denna grupp möss certifikatnummer: 0016003; laboratoriecertifikat nummer SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Experimentella läkemedel

Cistanche fenyletanolglykosidframställdes enligt metoden i experiment 1, och innehållet nådde 66,47%. Gengnian'an Kapsel, ingredienser: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, pionbark, Poria cocos, pärlemor, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum vinstockar, polygonum multiflorum, floating Unflorum vine . Funktioner och indikationer:Ge näring till yin och dämpa yang, lindra besvärochlugna sinnet. Används vid klimakteriets värmevallningar och svettning, yrsel, tinnitus, irritabilitet och sömnlöshet. Specifikationer: 0,3g per kapsel. Användning och dosering: Oral, 3 kapslar åt gången, 3 gånger om dagen. Tillverkare: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Produktionsbatchnummer: 121104. Godkännandenummer: National Drug Approval No. Z14021848.

HUR LÅNGE TAR DET FÖR CISTANCHE ATT ARBETA?

Sojaisoflavoner och mjuka vitamin E kapslar, ingredienslista: sojaisoflavonpulver, vitamin E, solrosolja, gelatin, glycerin, vatten, tartrazin, titandioxid. Ikoniska ingredienser och innehåll: Varje 100g innehåller 55,2 mg sojaisoflavoner (beräknat som genistein) och 608,5 mg vitamin E. Hälsofunktioner: Öka bentätheten. Instruktioner och dosering: Ta 1 kapsel 2 gånger om dagen med varmt vatten. Specifikationer: 500mg×100 kapslar. Tillverkare: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Produktionssatsnummer: 13070302. Godkännandenummer: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Experimentella reagenser

Natriumkarboximetylcellulosa, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., batchnummer: 20120418; penicillinnatrium för injektion, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikation: 4 miljoner enheter, produktionssatsnummer: c1206807; formaldehydlösning (analytisk kvalitet), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., produktionssatsnummer: 20130902; 0,9% natriumkloridinjektion, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikation: 250ml, produktionsbatchnummer: 1301265303;

Klorhydrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, batchnummer 20120827; mus E2 ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; mus T ELISA-detektionskit, FoU-företag, batchnummer: 20140101A; mus LH ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Mus FSH ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A;

Mouse DA ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Mus 5-HT ELISA-detektionskit, FoU-företag, batchnummer: 20140101A. 1.4 Experimentella instrument

Elektronisk våg, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., modell: JY601; elektronisk analytisk våg, Ohaus (Shanghai) Company, modell: AR1140/C; höghastighetsskrivbordscentrifug, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, modell: TGL-168 ; Elektriskt termostatiskt vattenbad, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., modell: HWS12; Testare för autonom aktivitet för mus, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modell: ZZ-6; Möss mörk undvikande mätare, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modell: BA-200; svansupphängningstestare, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modell: TS-200; höghastighets kyld centrifug, Zhongjia Branch of HKUST Innovation Co., Ltd., modell: KDC-160HR; justerbart pipetteringsinstrument, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;

Mikroplattläsare, American BIO-RAD Company, modell: 680;

Elektriskt mikroskop, Japan OLYMPUS Company, modell: BX61.

2 Experimentella metoder

2.1 Modellering och läkemedelsadministration

90 Kunming-honmöss med en kroppsvikt på 23-25g valdes ut, och 10 valdes slumpmässigt ut som den tomma gruppen och genomgick en skenoperation, och de återstående mössen användes för att skapa perimenopausala modeller. Efter vägning bedövades mössen genom intraperitoneal injektion av 10% kloralhydrat (0,03 ml/10 g) och bukpositionen fixerades. Sedan klipptes håret från baksidan av musen under det sista revbenet, vid skärningspunkten mellan den mittaxillära linjen och ca 1 cm från utsidan av ryggraden, och skars sedan in efter desinfektion. Hud- och ryggmusklerna är cirka 0,5-1cm breda. En mjölkvit glänsande fettmassa kan ses i snittfältet, och äggstocken är inbäddad i den. Använd en liten pincett för att försiktigt ta tag i fettmassan och dra ut den ur snittet, separera fettmassan så ser du en grupp tunna, oregelbundna, gulröda äggstockar. När du skär, ligera först äggledarna (inklusive fett) under äggstockarna med tunna trådar och ta sedan bort äggstockarna. Efter operationen sätts livmoderhornen tillbaka i bukhålan, muskler och hud sys ihop och båda äggstockarna tas bort på samma sätt. Efter operationen uppfostrades djuren noggrant och penicillin 200,000 u/kg (0,1 ml vardera) injicerades intramuskulärt för att förhindra infektion under 3 dagar i följd, en gång om dagen. 5 dagar efter operationen utfördes vaginal utstryksundersökning på varje mus en efter en, en gång om dagen under 5 dagar i följd för att fastställa om äggstockarna var helt borttagna. Mössen som uppvisade brunströs reaktion i utstryket kasserades och 60 helt kastrerade möss delades slumpmässigt och jämnt in i 6 grupper för experimentändamål, nämligen modellgrupp, Mengnianan-grupp, sojaisoflavongrupp, stor, medelstor ochLågdos Cistanche fenyletanolglykosidgrupp. Djuren i varje grupp fick motsvarande läkemedel på den tionde dagen efter operationen. Efter 6 dagars administrering uppfostrades möss i den tomma gruppen vid 5 per bur, med normal mat och vatten, utan någon stimulering. De 6 modellgrupperna växte alla upp med 1 mus per bur och gavs olika stimulanser slumpmässigt varje dag. Sju stressfaktorer applicerades slumpmässigt inom 18 dagar: fuktig strö (1 g strö/1 ml vatten); simma i isvatten (4 grader, 5 min); värmestress (45 grader, 5 min); över natten belysning (24h); svansklämning (1 min); vattenbrist (24 timmar); fasta (24h). En stimulans gavs slumpmässigt varje dag, och varje stimulus kunde inte uppträda kontinuerligt under 18 dagar.

Beredningsmetod: 0,5 % CMC Beredningsmetod: Väg upp 4 g karboximetylcellulosanatrium och blanda det med destillerat vatten till 800 ml.

Doserna av stora, medelstora och små doser av Cistanche fenyletanolglykosidgrupp var 200mg/kg, 10{{20}}mg/kg och 50mg/kg respektive (administrationsvolym 0,1ml/10g). Beredningsmetod: Väg 2000mg, 1000mg och 500mg Cistanche fenyletanoidglykosid respektive, lös upp dem med en liten mängd 0,5% CMC, justera sedan volymen till 100ml, blanda väl, och det är allt. Gengniangan kapslar (675 mg/kg, blandat med destillerat vatten till 67,5 mg/ml, 0,1 ml/10 g, motsvarande 15 gånger den kliniska dosen); Beredningsmetod: ta 9 Gengniangan-kapslar, använd först en liten mängd 0,5 % CMC Dissolve, justera sedan volymen till 40 ml och blanda väl för att erhålla dosen Gengnianan Capsule Suspension (675 mg/kg). Sojabönaisoflavon Vitamin E mjuk kapsel (250 mg/kg, använd destillerat vatten för att göra 25 mg/ml, 0,1 ml/10 g, motsvarande 15 gånger den kliniska dosen); Beredningsmetod: Ta 2 Sojabönor Isoflavone Vitamin E Soft Capsule, använd den först. Lös upp en liten mängd 0,5% CMC, justera sedan volymen till 40 ml och blanda väl för att erhålla dosen av sojaisoflavon vitamin E mjuk kapselsuspension (250mg/kg) ). Förvaringsmetod: kyl, håll varm under användning.

Administreringsmetod: Djuren i varje grupp fick motsvarande läkemedel den 10:e dagen efter operationen. Gengnian'an-gruppen gavs oralt Gengnian'an kapselsuspension 675 mg·kg-1, sojaisoflavongruppen administrerades oralt 250 mg·kg-1 sojaisoflavon vitamin E mjuk kapselsuspension, och stor, medium ochsmå doser Cistanchefenyletanol. Glykosidgruppen administrerades oralt stora, medelstora och små doser av Cistanche fenyletanolglykosid 200mg·kg-1, 10mg·kg-1, 50mg·kg{{ 5}}, 0,1 ml/10 g respektive. Blankgruppen och modellgruppen gavs med samma volym av 0,5 % CMC-lösning en gång om dagen under 30 dagar i följd.

2.2 Observationsobjekt och detektionsmetoder

Tvångssimning: Den första dagen efter avslutad kronisk stressstimulering mättes orörlighetstiden för möss i varje grupp inom 6 minuter i 2-6 minuter. (Sätt mössen i varje grupp i en 2000 ml bägare. Vattentemperaturen är 25 grader. Utöver den nödvändiga minimirörelsen som krävs för att hålla flytande, slutar djurens lemmar att röra sig och registreras som orörliga. Registrera den totala orörlighetstiden från 2 till 6 minuter inom 6 minuter.) Frivillig aktivitetstest: Den andra dagen efter avslutad kronisk stressstimulering mättes antalet spontana aktiviteter av möss i varje grupp inom 5 minuter.

Metod för att undvika mörker: På den 3:e dagen efter slutet av kronisk stressstimulering, sätt in musens svans i mätrutan vänd mot den lilla öppningen in i mörkrummet och genomför träning. Efter 24 timmar, mät om fördröjningen för musen som kommer in i mörkrummet för första gången och tiden det tar att komma in i mörkrummet inom 5 minuter. Antal elektriska stötar.

Svansupphängningstest: Den 5:e dagen efter slutet av kronisk stressstimulering mättes orörlighetstiden för möss i varje grupp inom 6 minuter under 2-6 minuter.

2 timmar efter den sista dosen (12 timmar utan mat eller vatten) vägdes mössen, ögongloberna avlägsnades, blod samlades upp, serumet separerades och innehållet av E2, T, LH och FSH i serumet mätt; mössen dödades sedan genom dislokation av halskotorna och mössen dissekerades. , ta bort tymus, mjälte och livmodervävnad, väg deras våta vikt och beräkna organindex (organindex=organ våtvikt mg/musvikt g), ta sedan bort hjärnan, skär av hälften och förbered hjärnan vävnadshomogenat. Enzymimmunanalys användes för att bestämma innehållet av monoaminneurotransmittorer 5-HT och DA i hjärnvävnadshomogenat. Tymus, mjälte, livmoder och hjärnvävnader fixerades i 10 % formaldehydlösning, inbäddades i paraffin, snittades och färgades med HE. De morfologiska förändringarna för varje grupp observerades under ett ljusmikroskop. 2.3 Metod för bestämning av kit

Skaffa serumprover: Använd provrör som är fria från pyrogener och endotoxiner. Undvik cellstimulering under operationen. Efter att ha samlat in blodet, centrifugera det vid 3000 rpm i 10 minuter för att snabbt och försiktigt separera serum och röda blodkroppar. Skaffa vävnadshomogenatprover: Tillsätt en lämplig mängd fysiologisk saltlösning till vävnaden och mosa den. Centrifugera vid 3000 rpm i 10 minuter och ta supernatanten.

Bestämningsmetoden för mus (mus) östradiol (E2) ELISA-kit är densamma som i experiment 2. Koncentrationerna av standardprodukter (S0-55) är: 0, 4, 8, 16, 32 och 64 pmol/L.

Bestämningsmetoden för mustestosteron (T) ELISA-kit är densamma som för estradiol (E2). Koncentrationerna av standardprodukter (S0-55) är: 0, 50, 100, 200, 400, 800pg/mL.

Bestämningsmetoden för musfollikelstimulerande hormon (FSH) ELISA-kit är densamma som för östradiol (E2). Koncentrationerna av standardprodukter (S0-55) är: 0, 5, 10, 20, 40 och 8{{30} } mIU/ml. Bestämningsmetoden för mus (mus) luteiniserande hormon (LH) ELISA-kit är densamma som för östradiol (E2). Koncentrationerna av standarden (S0-55) är: 0, 0,5, 1, 2, 4 och 8 mIU/ml. Bestämningsmetoden för mus 5-hydroxitryptamin (5-HT) ELISA-kit är densamma som för östradiol (E2). Koncentrationerna av standardprodukter (S0-55) är: 0, 15, 30, 60, 120, 240 ng/ml. Bestämningsmetoden för mus (mus) dopamin (DA) ELISA-detektionskit är densamma som för östradiol (E2). Koncentrationerna av standardprodukter (S0-55) är: 0, 7,5, 15, 30, 60 och 120 pg/ml.

Det kan ses från tabell 21 och figur 25 att jämfört med den tomma gruppen ökade orörlighetstiden för mössen i modellgruppen signifikant i experimenten med tvångssimning och svansupphängning (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Effekter på autonoma aktiviteter hos perimenopausala depressionsmodellmöss

Resultaten av det autonoma aktivitetstestet av möss i varje experimentgrupp visas i Tabell 22 och Figur 26.

Det kan ses från tabell 23 och figurerna 27 och 28 att jämfört med den tomma gruppen, var latensperioden för mössen i modellgruppen signifikant reducerad och antalet elektriska stötar ökade signifikant (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Effekter på organindex i perimenopausala depressionsmodellmöss

Det kan ses från tabell 24 och figur 29 att jämfört med den tomma gruppen var tymusindex, mjältindex och livmoderindex för modellgruppen signifikant reducerade (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Cistanche fenyletanolglykosidgrupp Brässindex och livmoderindex hos möss kan ökas signifikant (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).