GSK3-hämning genom fosforylering vid Ser389 kontrollerar neuroinflammation
Oct 24, 2023
Abstrakt: Hämningen av glykogensyntaskinas 3 (GSK3) genom Ser9-fosforylering påverkar många fysiologiska processer, inklusive immunsvaret. Konsekvenserna av GSK3-hämning av alternativ Ser389-fosforylering förblir dock dåligt karakteriserade. Här har vi undersökt neuroinflammation hos GSK3 Ser389 knock-in (KI) möss, där fosforyleringen av Ser389 GSK3 är nedsatt. Antalet aktiverade mikroglia/infiltrerade makrofager, astrocyter och infiltrerade neutrofiler var signifikant högre hos dessa djur jämfört med motsvarigheter av vildtyp C57BL/6J (WT), vilket tyder på att misslyckandet med att inaktivera GSK3 genom Ser389-fosforylering resulterar i ihållande låggradig neuroinflammation. Dessutom misslyckades gliacellsaktivering och hjärninfiltration av immunceller som svar på lipopolysackarid (LPS) hos GSK3 Ser389 KI-möss. Sådana effekter var hjärnspecifika, eftersom perifer immunitet inte påverkades på liknande sätt. Dessutom misslyckades fosforylering av IkB-kinaskomplexet (IKK) som svar på LPS i GSK3 Ser389 KI-möss, medan STAT3-fosforylering var helt konserverad, vilket tyder på att NF-KB-signalvägen är specifikt påverkad av denna GSK3-regulatoriska väg. Sammantaget indikerar våra fynd att GSK3-inaktivering genom Ser389-fosforylering kontrollerar hjärnans inflammatoriska respons, vilket ökar behovet av att utvärdera dess roll i utvecklingen av neuroinflammatoriska patologier.
cistanche tubulosa - Antiinflammatorisk
Nyckelord: neuroinflammation; mikroglia; astrocyter; neutrofiler; NF-KB-signalering; flödescytometri
Vad gör cistanche-ört-Anti-inflammatorisk
Klicka här för att se produkter från Cistanche
【Fråga för mer】E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Introduktion
Glykogensyntaskinas 3 (GSK3) är ett serin-treoninkinas med bred specificitet. GSK3 reglerar så olika processer som inflammation, celltillväxt, celldifferentiering och energimetabolism och är inblandad i åldersrelaterade sjukdomar som diabetes, Alzheimers sjukdom och cancer [1]. Båda GSK3-isoformer, GSK3 och GSK3, uttrycks överallt, men deras funktioner överlappar inte helt [2]. GSK3 är konstitutivt aktiv, även om dess aktivitet kan hämmas genom sekvestrering i cytosoliska komplex såväl som genom fosforylering vid resterna Ser9 och Ser389 [3]. Akt-inducerad fosforylering av GSK3 vid Ser9 är en GSK3-regulatorisk väg som finns i de flesta celltyper, och det är standardvägen för att begränsa GSK3-aktivering och förhindra celldöd. Däremot har vi funnit att p38 MAPK-inducerad Ser389-fosforylering är begränsad till specifika vävnader såsom hjärnan, tymus och mjälte [4] och att hjärnuttrycket av fosfo-Ser389 GSK3 är utvecklingsmässigt reglerat [5]. Fosforyleringen av GSK3 av Ser389 utlöses främst av DNA-dubbelsträngbrottssvar och det är avgörande att tillåta DNA-reparation [6,7]. Sålunda, medan fosforylering på Ser9 är huvudvägen för inaktivering av cytoplasmatisk GSK3, används Ser389-fosforylering för att inaktivera den nukleära poolen av GSK3 för att öka överlevnaden under DNA DSB-reparation [8]. Underlåtenhet att inaktivera GSK3 genom Ser389-fosforylering som svar på DSB leder till ökad celldöd genom nekroptos [6,7]. Detta är högst relevant eftersom den nekroptotiska dödstypen är mer inflammatorisk och har hittats vid inflammatoriska sjukdomar [9]. Men till skillnad från fosforyleringen av Ser9 förblir implikationerna av fosforylering av GSK3 på Ser389 dåligt karakteriserade. Ett antal studier har stött sambandet mellan GSK3 och inflammation. Aktivering av GSK3 genom inflammatoriska stimuli såsom stress, infektion eller trauma främjar således produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner såsom IL-6, IL-1 och IFN, medan GSK3-hämning undertrycker syntesen av pro-inflammatoriska mediatorer och ökar IL-10-produktionen av immunceller [10]. GSK3 kan aktiveras av lipopolysackarid (LPS), en av de viktigaste immunstimulerande endotoxinerna från gramnegativa bakterier [11,12]. Vid bindning av bakteriell LPS till Toll-liknande receptorer (TLR), medierar GSK3 frisättningen av inflammatoriska cytokiner i celler i det medfödda immunsystemet [13]. Dessutom har det rapporterats att administrering av GSK3-hämmare till möss som behandlats med en dödlig dos av LPS signifikant ökar djurens överlevnad [14]. Trots dessa pro-inflammatoriska effekter associerade med GSK3, har antiinflammatoriska effekter också dokumenterats [15,16]. Således är GSK3-reglering avgörande för att upprätthålla balansen mellan pro- och antiinflammatoriska cytokiner efter TLR-aktivering [17]. Nukleär faktor kB (NF-kB) förmedlar produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner och är en av de viktigaste transkriptionsfaktorerna som aktiveras av TLR. Flera författare har bekräftat att GSK3 kan aktivera NF-kB-signalering genom fosforylering av IkB-kinaskomplexet (IKK), som fosforylerar IkB och frisätter aktivt NF-kB. En annan transkriptionsfaktor som fosforyleras av GSK3 är en signalgivare och aktivator av transkription -3 (STAT3), som förmedlar neuroinflammation i samband med septisk chock [18]. STAT3-fosforylering av GSK3 resulterar i nukleär translokation och aktivering. Dessutom hämmar GSK3 antiinflammatoriska CREB och AP-1 transkriptionsaktiviteter, vilket förstärker uttrycket av proinflammatoriska cytokiner [10,19]. Mikrogliaceller är bosatta makrofager i CNS. Tillsammans med infiltrerade leukocyter spelar mikrogliaaktivering en avgörande roll vid neuroinflammation. Astrocyter är också gliaceller med neuroimmuna funktioner eftersom de överhör med mikroglia, leukocyter och endotelceller, vilket modulerar både medfödda och adaptiva immunsvar [20]. Aktivering av mikroglia och astrocyter som svar på inflammatoriska stimuli (glios) kännetecknas av stora cellulära förändringar som inkluderar proliferation, hypertrofi och cytokinfrisättning [21]. GSK3 har varit involverad i utvecklingen av glios som svar på LPS eller genom överuttryck av neural GSK3 [22]. Det finns också bevis för att glialreaktivitet och neuroinflammation inducerad av GSK3 kan medieras genom aktivering av NF-kB-vägen i hjärnan [19,23]. Däremot minskar inaktiveringen av GSK3 glialreaktiviteten, begränsar det neuroinflammatoriska svaret och ökar antiinflammatorisk CREB-aktivitet i neurala celler [24]. Följaktligen har det föreslagits att GSK3 spelar en grundläggande roll i utvecklingen av neuroinflammatoriska störningar, såsom Alzheimers sjukdom och multipel skleros [25]. Fosforylering är en reglerande mekanism för GSK3-aktivitet med stora implikationer för kontrollen av immunsvaret. Således uppreglerar GSK3-hämning genom klassisk Ser9-fosforylering produktionen av antiinflammatoriska mediatorer och nedreglerar frisättningen av pro-inflammatoriska cytokiner [26], även om det också är involverat i upplösningen av inflammation i en modell av experimentell kolit inducerad av trinitrobensensulfonsyra [27]. Inom hjärnan har defekt hämning av GSK3 genom Ser9-fosforylering relaterats till inflammatoriska neuropatologier som Parkinsons sjukdom [28] och schizofreni [29]. Däremot, trots de höga nivåerna av fosfo-Ser389 GSK3 som finns i hjärnan [4], är det fortfarande okänt om denna väg för inaktivering av GSK3 spelar en roll för att trimma neuroinflammation. Här undersöker vi den möjliga rollen av Ser389-fosforyleringsmedierad GSK3-inaktivering i neuroinflammation med användning av GSK3 KI-möss där GSK3 Ser389 ersattes av Ala för att förhindra den C-terminala fosforyleringen av GSK3 [7,8]. Våra resultat visar att underlåtenhet att inaktiva GSK3 genom fosforylering vid Ser389 under fysiologiska förhållanden leder till kronisk låggradig neuroinflammation såväl som bristen på svar på inflammatoriska stimuli som LPS. Denna kroniska inflammation verkar vara specifik för hjärnan eftersom det perifera immunförsvaret i stort sett är opåverkat. Vi visar också att frånvaron av fosfo-Ser389 GSK3 i hjärnan hos GSK3 KI-möss reglerar NF-kB-signalering, vilket är en central händelse i kontrollen av neuroinflammation. Därför ger våra fynd stöd för involveringen av GSK3-inaktivering genom Ser389-fosforylering i inflammatoriska neuropatologier.
2. Resultat
2.1. Underlåtenhet att inaktivera GSK3 av Ser389-fosforylering leder till ökad basal neuroinflammation
Inaktivering av GSK3 genom fosforylering på Ser9 har associerats med ett antiinflammatoriskt stadium i hjärnan [30]. Även om inaktiveringen av GSK3 genom fosforylering på Ser389 är viktig för att minska neuronal död orsakad av DNA dubbelsträngbrott i hjärnan, har inga studier undersökt om denna väg också kan reglera det neuroinflammatoriska svaret. Vi använde därför de tidigare beskrivna GSK3 Ser389 KI-mössen, i vilka Ser389 är ersatt av Ala, för att förhindra Ser389-fosforylering. Vi undersökte residenta och infiltrerade immunceller i hela hjärnan (förutom lillhjärnan och luktlökar) från WT- och GSK3 Ser389 KI-möss genom mekanisk dissociation av vävnaden och Percoll-gradienten, enligt ett tidigare optimerat protokoll för att erhålla en balanserad blandning av bosatta och infiltrerade celler i hjärnan, inklusive mikroglia/makrofager, astrocyter, infiltrerade neutrofiler och lymfocyter [31]. Celler analyserades sedan med flödescytometri med standardmarkörer (Figur S1 i tilläggsmaterial) [31-33]. Aktiverade och vilande mikroglia/makrofager identifierades som CD11b+CD45high respektive CD11b+CD45low, medan lymfocytpopulationen markerades som CD45+CD11b- [32,34]. Neutrofiler karakteriserades som CD45+Ly6G+-celler; och astrocyter definierades inom CD45−-populationen genom uttryck av cellytantigenet -2 (ACSA-2). Denna markör används för detektion av utvecklande och vuxna astrocyter [35]. Uppreglering av ACSA -2 har observerats i reaktiva astrocyter associerade med inflammatoriska tillstånd, såsom autoimmun demyelinisering [36]. Vi har tidigare funnit att antalet ACSA-2+-astrocyter i möss hjärnor ökar efter LPS-behandling, vilket ytterligare indikerar att nivån av ACSA-2-uttryck korrelerar med astrocytaktivering som svar på inflammatoriska stimuli [31]. Även om ACSA-2 också kan uttryckas i en liten subpopulation av mikroglia och makrofager [35], är dessa celler inom CD45+-populationen. Flödescytometrianalys av hjärncellsisolaten från möss under fysiologiska förhållanden visade en markant ökning av andelen aktiverade mikroglia/makrofager i GSK3 Ser389 KI-möss jämfört med WT-möss (Figur 1a). Däremot minskade andelen vilande mikroglia i hjärnan hos GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 1b). Dessutom var det en markant ökning av närvaron av ACSA-2+-astrocyter (dvs. aktiverade astrocyter) i GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 1c). När det gäller immuncellsinfiltration i hjärnan fanns det en tydlig ackumulering av neutrofiler i hjärnan hos GSK3 Ser389 KI-möss i förhållande till WT-möss (Figur 1d), vilket ytterligare visar närvaron av pågående inflammatorisk respons i hjärnan hos GSK3 Ser389 KI-möss under fysiologisk betingelser. Frekvensen av CD45+CD11b-leukocyter (främst lymfocytiska celler) i hjärnan påverkades dock inte hos GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 1e). Tillsammans visar dessa resultat att misslyckande med att hämma GSK3 genom fosforylering vid Ser389 leder till en kronisk medfödd inflammatorisk respons i hjärnan som orsakar reaktivitet mellan mikroglia och astrocyter.
Figur 1. Inaktivering av GSK3 genom Ser389-fosforylering påverkar hjärncellpopulationer som är inblandade i neuroinflammation. Hjärnor från både WT- och GSK3 Ser389 KI-möss avlägsnades och bearbetades för flödescytometrianalys av (a) CD11b++CD45högaktiverade mikroglia/makrofager, (b) CD11b++CD45låg vilande mikroglia, (c) ACSA -2+ astrocyter, (d) Ly6G+ neutrofiler och (e) CD11b− lymfocyter. Histogram representerar cellantal, uttryckt som procentandelen CD45−celler (astrocyter) eller CD45+-celler (alla andra populationer). Data visas som medelvärde ± SEM (n=7–9). Student t-test användes för att jämföra genotyper. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, vildtyp; KI och GSK3 Ser389 knockin.
2.2. Brist på effekt av GSK3-fosforylering vid Ser389 på mjältceller
För att undersöka om det förändrade inflammatoriska tillståndet som upptäckts i GSK3 Ser389 KI-möss är begränsat till hjärnan eller om effekten också är systemisk, utförde vi flödescytometrianalys för de olika cellpopulationerna i mjälten. Neutrofiler identifierades som Ly6G+-celler. Ly6G uttryck var mycket varierande eftersom det beror på mognadsstadiet av celler, som tidigare visats [37]. Dessutom märktes monocytiska myeloidceller som Ly6G–CD38+CD11b+-celler. Dessa monocyter/makrofager presenterade två klart distinkta populationer baserat på nivåerna av CD38-uttryck, som tidigare rapporterats [38]. CD8+-celler, CD4+-celler och B220+-celler (B-celler) utvärderades också (Figur S2 i tilläggsmaterial).
Figur 2. Flödescytometrianalys visar liknande mjältcellpopulationer i WT- och GSK3 Ser389 KI-möss. Efter dissocieringen av mjältceller användes flödescytometri för att bedöma antalet (a) Ly6G+ neutrofiler, (b) CD38+CD11b+ monocyter/makrofager, (c) CD4+ celler, (d) CD8+-celler och (e) B220+-celler. Histogram visar cellantal uttryckt som en procentandel av det totala antalet celler. Data motsvarar medelvärde ± SEM (n=5–7). Student t-test användes för att jämföra genotyper. WT, vildtyp; KI, GSK3 Ser389 knockin.
2.3. LPS kan inte öka neuroinflammation hos GSK3 Ser389 KI-möss
Därefter undersökte vi om avskaffande av Ser389-fosforylering, förutom att orsaka basal tonisk inflammation, också kan påverka det inflammatoriska svaret som utlöses av LPS. WT- och GSK3 Ser389 KI-möss injicerades intraperitonealt med en subletal dos (0,5 mg/kg) av bakteriell lipopolysackarid (LPS). Det inflammatoriska svaret i hjärnan undersöktes tre dagar senare eftersom sådan behandling tidigare har visat sig ge låggradig inflammation i möss hjärnor [39,40]. Detta LPS-svar liknar också det kroniska inflammatoriska tillståndet som observerats i flera neurologiska sjukdomar, inklusive depression, ångest och Parkinsons sjukdom [41,42]. Som förväntat inducerade LPS glialreaktivitet i WT-möss, vilket bestäms av ökningen av frekvensen av aktiverade mikroglia/makrofager (Figur 3a) och minskad frekvens av vilande mikroglia (Figur 3b). Däremot misslyckades LPS med att utlösa något ytterligare inflammatoriskt svar i GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 3a,b). Tabell 1 jämför direkt storleken på LPS-svar mellan de två genotyperna. Dessutom ökade denna LPS-behandling andelen ACSA-2+-astrocyter i WT-möss, som tidigare rapporterats [31], men inte i GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 3c). När det gäller hjärninfiltration av immunceller orsakade LPS en ansamling av neutrofiler i WT-möss men hade ingen effekt i GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 3d). Slutligen främjade LPS-administrering inte lymfocytackumulering i hjärnan i varken WT- eller GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 3e). Sammantaget indikerar dessa observationer att inaktiveringen av GSK3 genom Ser389-fosforylering är väsentlig för att förhindra ett toniskt inflammatoriskt tillstånd i hjärnan men bidrar till akut hjärninflammation som svar på stimuli såsom LPS.
Tabell 1. Skillnader i LPS-effekter mellan WT- och GSK3 Ser389 KI-möss. Värden representerar cellantal efter LPS-behandling i varje genotyp och uttrycks som en ökning med avseende på vehikelbehandlade kontroller (medelvärde ± SEM). Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan effekterna av LPS i WT- och GSK3 Ser389 KI-djur. WT, vildtyp; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysackarid. *, p < 0.05; **, p < 0,01.
Figur 3. Neuroimmunceller från GSK3 Ser389 KI-möss svarar inte på LPS. Vuxna WT- och GSK3 Ser389 KI-möss injicerades intraperitonealt med LPS (0,5 mg/kg). Tre dagar senare, hjärnpopulationer av (a) CD11b++CD45högaktiverade mikroglia/makrofager, (b) CD11b+CD45lågvilande mikroglia, (c) ACSA-2+ astrocyter, (d) Ly6G+ neutrofiler, och ( e) CD11b-lymfocyter utvärderades med flödescytometri. Histogram visar LPS-effekter på cellantal i båda genotyperna. Data presenteras som procentandelar av CD45−celler (astrocyter) eller CD45+-celler (alla andra populationer), och värdena motsvarar medelvärde ± SEM (n=7–9). Student t-test användes för att utvärdera betydelsen av förändringar inducerade av LPS i varje genotyp. ** p < 0.01. WT, vildtyp; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysackarid.
Därefter undersökte vi den möjliga påverkan av hippocampus GSK3 Ser389-fosforylering på basal glialaktivering och glialsvaret på inflammatoriska stimuli. För detta syfte utvärderades Iba-1-märkning med mikroskopi i dentata gyrusen (Figur 4a). Först utvärderades WT-möss. Mikrofotografier avslöjar låg basal glialaktivering, men en kraftig ökning av glialimmunreaktivitet som svar på LPS-injektion (0,5 mg/kg, 3 dagar) (Figur 4b). Kvantifiering av den integrerade densiteten för Iba-1-immunfärgning visade värden som var 53 % högre i WT-möss efter behandling (Figur 4d). Dessa förändringar var statistiskt signifikanta och överensstämmer med den framträdande cellulära hypertrofin som orsakas av LPS i mushippocampus som tidigare rapporterats [43,44].
Figur 4. Gliosis som svar på LPS är förändrad i GSK3 Ser389 KI-möss. Vuxna WT- och GSK3 Ser389 KI-möss injicerades intraperitonealt med LPS eller vehikel (C). Efter 3 dagar bearbetades hjärnor för fluorescerande mikroskopi. (a) En koronal hippocampus-sektion anpassad från mushjärnatlasen [45] indikerar lokaliseringen av bilderna, som inkluderar dentate gyrus. (b) Hjärnsektioner immunmärktes för mikroglia/makrofagmarkörer Iba-1. Grafer visar den integrerade tätheten av Iba-1-immunreaktivitet, vilket är ett mått på glialreaktivitet som återspeglar både intensiteten och förlängningen av glialfärgning. (c) Jämförelse av kontroll WT- och KI-djur. (d) LPS-svar i varje musgenotyp. Alla värden uttrycks med ökad respekt för WT-kontroller som behandlats med vehikel (medelvärde ± SEM, n=4–5). Student t-test tillämpades. *, p < 0.05. Skalstång, 100 µm. WT, vildtyp; KI, GSK3 Ser389 knockin; C, fordon; LPS, lipopolysackarid.
Analysen av hippocampus hos Ser389 KI-möss avslöjade skillnader i basal mikroglialaktivering med avseende på WT-möss. Sålunda, även om visuell inspektion av mikrofotografier visade en måttlig glialaktivering i muterade djur (Figur 4b), indikerade integrerade densitetsmätningar att ökningen av glialimmunreaktivitet var statistiskt signifikant (Figur 4c). Intressant nog visade Ser389 KI-möss inga tecken på ytterligare aktivering efter LPS-behandling (Figur 4b), och kvantitativ analys bekräftade att LPS inte kunde öka Iba-1-immunfärgning i hippocampus (Figur 4d), vilket tyder på att gliacellsaktivering genom LPS är försämrad i frånvaro av GSK3 Ser389-fosforylering.
cistanche tilläggsförmåner—Anti-inflammatorisk
2.5. Perifert immunsvar mot LPS påverkades inte i GSK3 Ser389 KI-möss
Våra tidigare experiment avslöjar de djupgående konsekvenserna av GSK3-inaktivering genom Ser389-fosforylering på hjärnans svar på LPS. Därefter tog vi upp om liknande effekter finns i systemisk immunitet. Eftersom LPS är känt för att orsaka aktivering av mjältens medfödda immunceller [46], utvärderades mjältcellpopulationer från både WT- och GSK3 Ser389 KI-möss 3 dagar efter LPS-injektion (0,5 mg/kg). antalet Ly6G+-neutrofiler (Figur 5a) och CD38++CD11b++Ly6G−monocyter/makrofager (Figur 5b) ökade signifikant i WT-möss som svar på LPS-behandling. Dessa LPS-effekter, förväntade i WT-möss, observerades också i GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 5a,b). Inga skillnader mellan genotyper erhölls heller när lymfocytpopulationer från mjälten analyserades, eftersom procentandelen CD4+-celler från mjälte (Figur 5c) och CD8+-celler (Figur 5d) reducerades av LPS även i båda mösssträngarna (minskningen av muterade möss var statistiskt signifikant endast för CD4+-celler); och B220+ B-celler var opåverkade av LPS oberoende av genotyp (Figur 5e). Dessa observationer står i kontrast till de differentiella effekterna av LPS som finns i hjärnan hos båda genotyperna. Sålunda, medan GSK3 Ser389 KI-möss är resistenta mot neuroinflammation som utlöses av LPS, är dessa möss inte systemiskt desensibiliserade mot LPS. Därför verkar effekterna av GSK3 Ser389-fosforylering vara selektiva för hjärnan.
Figur 5. Liknande perifert immunsvar mot LPS i GSK3 Ser389 KI- och WT-möss. Vuxna WT- och GSK3 Ser389 KI-möss injicerades ip med LPS. Efter 3 dagar extraherades mjältceller och bearbetades för att utvärdera, genom flödescytometri, antalet (a) Ly6G+ neutrofiler, (b) CD38+CD11b+ monocyter/makrofager, (c) CD8+, (d) CD4+ och (e) B220+ celler. Histogram visar effekterna av LPS på cellantal, inklusive WT- och KI-möss. Student t-test användes för att utvärdera betydelsen av förändringar inducerade av LPS i varje genotyp. Medelvärde ± SEM visas (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, vildtyp; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneal; C, fordon; LPS, lipopolysackarid.
2.6. LPS-inducerad NF-KB-vägaktivering i Hippocampus avskaffas i GSK3 Ser389 KI-möss
NF-KB är en transkriptionsfaktor som är avgörande för att LPS ska inducera inflammation [47]. Dessutom har NF-KB visat sig regleras av GSK3 i hjärnan [2,19,23]. Vi undersökte därför NF-KB-aktivering i hjärnan som svar på LPS genom analys av IKK-fosforylering, ett tidigt steg i NF-kB-aktiveringsvägen. WT- och GSK3 Ser389 KI-möss administrerades ip med LPS (0,5 mg/kg) och efter 4 timmar skördades hippocampus. Helcellsextrakt användes för att undersöka fosfo-IKK / och total IKK / genom Western blotting. Som förväntat ökade LPS IKK-fosforylering i hippocampus hos WT-möss (Figur 6a,b). Däremot misslyckades LPS med att inducera IKK-fosforylering i GSK3 Ser389 KI-möss (Figur 6a,b). Aktivering av STAT3 har också associerats med LPS-inducerad inflammation [48]. Vi undersökte därför fosforyleringen av STAT3 genom Western blot-analys. I motsats till NF-kB-aktivering inducerades fosforylering av STAT3 starkt i hippocampus hos både WT- och GSK3 Ser389 KI-möss som svar på LPS (Figur 6a, c). Att förhindra GSK3-inaktivering genom Ser389-fosforylering försämrar således NF-KB-signalering selektivt, vilket överensstämmer med en roll för GSK3 som en uppströmsregulator av NF-KB-vägen i hippocampus. Dessa resultat tyder på att GSK3-vägen påverkar neuroinflammation genom att kontrollera viktiga inflammatoriska mediatorer, såsom NF-KB.
Figur 6. Misslyckande att inaktivera GSK3 genom Ser389-fosforylering påverkar NF-KB- och STAT3-signalering på olika sätt hos LPS-behandlade möss. Aktivering av NF-KB- och STAT3-vägarna undersöktes i helcellslysat från hippocampus 4 timmar efter ip-injektion av LPS ({{10}},5 mg/kg) eller vehikel (C) i båda WT och GSK3 Ser389 KI möss. Blots illustrerar Western blot-analysen av fosfor-IKK/, total IKK/, fosfor-STAT3 och total STAT3. (a) -tubulindetektion inkluderades som en laddningskontroll. Associerade grafer motsvarar (b) fosfo-IKK//IKK/- och (c) fosfo-STAT3/STAT3-förhållanden, erhållna från densitometriska analysen av Western blot-band. Student-t-test användes för att jämföra obehandlade kontroller (C) och LPS-behandlade djur i varje genotyp (medelvärde ± SEM, n=5–6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Data är representativa för fyra oberoende experiment för pIKK/IKK och tre oberoende experiment för pSTAT3/STAT3. WT, vildtyp; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneal; C, fordon; LPS, lipopolysackarid.
3. Diskussion
I hjärnan är dysreglering av GSK3-aktivitet kopplad till flera neuropatologier där kronisk inflammation är ett vanligt kännetecken [25]. Eftersom en stor litteratur stödjer att hämning av GSK3 genom Ser9-fosforylering uppreglerar antiinflammatoriska mediatorer och nedreglerar pro-inflammatoriska cytokiner [23,28,30], är den mekanism som vanligtvis föreslagits för att förklara defekt GSK3-inaktivering i neuroinflammatoriska patologier misslyckande med att fosforylera Ser9 [3]. Men ovanligt höga nivåer av fosfo-Ser389 GSK3 har upptäckts i hjärnan [4], vilket tyder på att denna alternativa väg för GSK3-inaktivering också kan spela en framträdande roll i hjärnan. Experimenten som presenteras här avslöjar implikationen av GSK3 Ser389-fosforylering i neuroinflammation, vilket lägger till tidigare bevis som tyder på involveringen av denna väg i hjärnans DNA-reparation och neuronal överlevnad [6,7]. Ett av nyckelfynden i detta arbete är att hjärnan hos GSK3 Ser389 KI-möss visar ihållande glios och ökad immuncellsinfiltration, vilket är förenligt med uppfattningen att förhindrande av GSK3-inaktivering genom Ser389-fosforylering leder till neuroinflammation. Data från våra flödescytometriexperiment pekar tydligt på ökad neuroinflammation hos dessa djur, eftersom antalet aktiverade mikroglia/makrofager, ACSA 2+-astrocyter och infiltrerade neutrofiler i hjärnan hos Ser389 GSK3 KI-möss var signifikant högre. Trots att mikroastroglios tydligt observerades med flödescytometri, visade analys av hippocampusmikrofotografier från hjärnsektioner av Ser389 GSK3 KI-möss att hypertrofi av mikroglia/makrofager endast var mild. Liknande resultat observerades när andra hjärnområden analyserades för att bedöma omfattningen och intensiteten av glios (ej visat). Därför drar vi slutsatsen att i frånvaro av proinflammatoriska stimuli leder bristen på GSK3 Ser389-fosforylering till en grad av neuroinflammation som bör klassificeras som låggradig. Många studier stöder sambandet mellan GSK3-hyperaktivitet och neurodegeneration vid neurologiska störningar [25]. I detta sammanhang kan det inflammatoriska svaret som vi observerade i Ser389 GSK3 KI-möss vara konsekvensen av neurodegeneration, eftersom tidigare studier har upptäckt neuronal död i cortex och hippocampus hos dessa djur [6]. Detta är i enlighet med observationen att DNA-skada inaktiverar GSK3 genom Ser389-fosforylering som en mekanism för att förhindra celldöd och främja DSB-reparation [7,8]. Som en konsekvens är hjärnan hos KI-möss, i vilka Ser389-fosforylering förhindras, inte skyddad mot DSB-inducerad neuronal död. Kopplingen mellan fosfor-Ser389 GSK3-uttryck och cellöverlevnad föreslogs först i lymfocyter, som en mekanism inblandad i det adaptiva immunsvaret. Således visade sig frånvaron av GSK3 Ser389-fosforylering i KI-möss inducera nekroptos i B-celler under dess sena mognad, vilket är en mycket inflammatorisk typ av celldöd relaterad till flera patologier [9]. Det är också intressant att notera att inte bara Ser389-fosforylering utan även Ser9-fosforylering kan utlösas för att inaktivera GSK3 som svar på DNA-skada. Ser389 GSK3 KI-möss uppvisar dock en neurodegenerativ fenotyp [6] som inte finns i Ser9 GSK3 KI-möss [49,50], vilket indikerar att Ser389-fosforylering spelar specifika roller i kontrollen av GSK3-aktivitet och att det finns scenarier där Ser9-fosforylering inte kan kompensera för förlusten av Ser389-fosforylering. Följaktligen måste den spännande kopplingen mellan Ser389 GSK3-avreglering, neuroinflammation och neurodegeneration som avslöjas här ytterligare utforskas för att klargöra om förändrad GSK3-fosforylering vid Ser389 kan vara en nyckelfaktor i neuropatologier där kronisk inflammation är utmärkande, såsom Alzheimers sjukdom. Dessutom överensstämmer den milda men ihållande aktiveringen av neuroimmuna celler som observerats i GSK3 Ser389 KI-möss med hypotesen att misslyckande med att fosforylera Ser389 kan vara associerad med immunosenescens. Detta är en åldersrelaterad process som kännetecknas av en nedgång i immunfunktioner tillsammans med en ökning av uttrycket av proinflammatoriska mediatorer; vilket leder till kronisk låggradig inflammation [1,51]. Flera författare har pekat på inblandningen av GSK3-avreglering i åldersrelaterad inflammation [1,52]. Det har också föreslagits att den onormala funktionen hos mikroglia som observeras i samband med hjärnans immunosenscens så småningom kan orsaka neurodegeneration [53]. Således kan accelererad immunosenscens i Ser389 GSK3 KI-möss bidra till förlusten av neuroner som tidigare rapporterats i dessa djur [6]. LPS har använts i stor utsträckning för att inducera inflammation i både "in vivo" och "in vitro" modeller. Det finns dock bevis för att dosen av LPS som administreras till stor del bestämmer vilken typ av inflammatoriskt svar som induceras [54-56]. Höga doser av LPS ger septiska chockliknande svar; medan måttliga LPS-doser utlöser en ihållande låggradig inflammation närmare den som observeras i många kroniska sjukdomar [42]. I detta sammanhang är det viktigt att betona att den LPS-dos som valts för våra experiment (0,5 mg/kg, ip) är måttlig och är långt ifrån den LD50 som rapporterats för LPS hos möss (10–25 mg/kg) [57,58 ]. I överensstämmelse med tidigare rapporter [40,59] fann vi att en sådan LPS-dos inte är dödlig och är tillräcklig för att öka glios och hjärninfiltration av neutrofiler i WT-djur, medan lymfocytinfiltration inte påverkas. Anmärkningsvärt nog avskaffades ett sådant måttligt (men signifikant) LPS-svar i hjärnan hos KI-möss med försämrad inaktivering av GSK3 genom Ser389-fosforylering. Enligt denna observation kan utökad GSK3-hyperaktivering i hjärnan så småningom nedreglera känsligheten för pro-inflammatoriska förolämpningar. Det är anmärkningsvärt att det defekta svaret på LPS hos mutantmössen är kompatibelt med mekanismen för immuntolerans eller resistens, en vanlig process i CNS som syftar till att minska gliacellsaktivering och begränsa hjärnskador från överdriven inflammation [60,61]. I överensstämmelse med denna idé visade en tidigare studie att GSK3-aktivering hos möss kan inducera immuntolerans och undertrycka LPS-svar [62].
Fördelarna med cistanche tubulosa-stärka immunförsvaret
Det är också intressant att tänka på att de hjärneffekter som beskrivs i denna studie visar hög specificitet. Sålunda, i motsats till hjärnan, visade de flesta mjältcellpopulationer som utvärderades i WT- och Ser389 GSK3 KI-djur samma profil under ostimulerade förhållanden, såväl som ett liknande svar på LPS. Detta tyder på att GSK3-inaktiveringsvägen beroende av Ser389-fosforylering spelar specifika roller i regleringen av neuroinflammation. I överensstämmelse med denna hypotes visar hjärnceller ett högt uttryck av fosfo-Ser389 GSK3 jämfört med andra vävnader, och detta uttryck är hårt reglerat under hjärnans utveckling [5]. Slutligen, enligt våra fynd, förmedlas regleringen av GSK3 genom fosforylering vid Ser389 specifikt av NF-kB-signalvägen, eftersom STAT3-aktivering var opåverkad i Ser389 GSK3 KI. Många nedströms inflammatoriska mediatorer regleras av NF-kB-aktivering, inklusive cytokiner, receptorer, transkriptionsfaktorer och enzymer. Att identifiera vilka av dessa NF-kB-mål som påverkas av Ser389 GSK3-fosforylering ligger utanför vårt arbete, men det kommer att vara ett spännande mål för framtida studier som syftar till att klargöra mekanismerna för neuroinflammation.
4. Material och metoder
4.1. Djur
C57BL/6J vildtypsmöss (WT) köptes från Jackson Laboratories. C57BL/6 GSK3 Ser389 KI-möss, i vilka Ser389-resten av GSK3 ersattes med Ala för att förhindra fosforylering, genererades som tidigare beskrivits [8]. Alla möss hölls i djuranläggningen som är associerad med Albacete Medical School under en 12-ljus/mörkercykel. Mat och vatten tillhandahölls ad libitum. Fyra till sex månader gamla vuxna möss användes för experimenten.
4.2. LPS administration
För att inducera ett inflammatoriskt svar fick mössen en enda intraperitoneal (ip) injektion av {{0}},5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (serotyp typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Spanien) löstes i steril, endotoxinfri 0,9 % saltlösning vid 10 mg/ml. Tre dagar efter behandlingen avlivades mössen och hjärnan och mjälten avlägsnades för immunhistokemi eller flödescytometrianalys av gliaceller och infiltrerade immunceller. För Western blotting-analys avlivades djuren 4 timmar efter ip-injektion av 0,5 mg/kg LPS, eftersom LPS tidigare har rapporterats uppreglera inflammatoriska proteiner i mus- och råtthjärnor 2-4 timmar efter ip-administrering [63,64].
4.3. Flödescytometri
För flödescytometrianalys av hjärnvävnad och mjältceller bedövades djuren med en ip-injektion av tribrometanol, vilket har rekommenderats för akuta terminala studier. Den låga dosen av tribrometanol som används (200 mg/kg) ger lätt anestesi utan allvarliga negativa effekter eller påverkan på inflammatoriskt cytokinuttryck [65]. Djurprocedurer utfördes efter att ha verifierat frånvaron av reflexer.
4.3.1. Hjärnvävnadsdissociation och Percoll-gradientisolering av neurala celler
Möss perfunderades intrakardiellt med 50 mL 0,9 % NaCl före vävnadsuppsamling för att avlägsna cirkulerande celler från hjärnans blodkärl. Efter perfusion avlägsnades hjärnorna, hjärnhinnorna och plexus choroidal separerades försiktigt och lillhjärnan och luktlöken kasserades. Den återstående vävnaden placerades i kall Hank's Balanced Salt Solution, som är kalciumklorid- och magnesiumkloridfri (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Spanien, 14175). Vävnadsprover finhackades sedan med en skalpell före digestion. Hackad vävnad placerades sedan i MACS C-rör (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Spanien, 130-093-237) i en total volym av 5 ml och bearbetades med en mekanisk dissociator vid 6 rpm under 30 min. Enzymatisk dissociation utfördes enligt vårt eget protokoll [31] med papain (100 U; Worthington, LK003178) och dispase II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spanien, D4963) i Earle's Balanced Salt Solution (EBSS [+]CaCl2 /[+]MgSO4; Gibco, Madrid, Spanien, 24010). DNAse I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spanien, DN25) sattes till lösningen för att avlägsna DNA-slem som negativt påverkar cellviabiliteten [66]. Före användning aktiverades papain i 30 minuter vid 37 ◦C i 5 % CO2. För att stoppa matsmältningen späddes proverna med kall HBSS och placerades på is. Denna lösning pipetterades sedan 10 gånger med användning av 5 ml pipetter och filtrerades genom en 70 µm cellsil (BD, 352350). Den resulterande encellssuspensionen centrifugerades vid 300 x g under 10 minuter vid RT. En 30 % PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Spanien, 17-0891-01) gradient användes för att avlägsna myelin och berika homogenatet till livskraftiga gliaceller. För detta ändamål bereddes en stamlösning av isotonisk Percoll (SIP) (9:1 Percoll i 10× HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185), och cellpellets återsuspenderades i 30% (v/ v) SIP (i 1× HBSS). 30% Percoll-gradienten utfördes genom att tillsätta 3 ml SIP till 7 ml 1 x HBSS innehållande cellsuspensionen i ett 14 ml polypropenrör. Varje gradient centrifugerades utan broms vid 300 x g under 30 minuter vid 18 ◦C. Efter centrifugering samlades cellerna från bottenskiktet, tvättades med 1 x HBSS, centrifugerades i 10 minuter vid 300 x g och återsuspenderades i 10 ml 1 x lyseringsbuffert för röda blodkroppar vid 4 ◦C. Efter lysering centrifugerades cellsuspensionen vid 300 x g under 10 minuter, och den resulterande cellpelleten återsuspenderades slutligen i 50 µL blockerande buffert innan färgning för flödescytometri.
4.3.2. Mjältcellsdissociation
Mjältar placerades på en petriskål innehållande RPMI 1640 och skars i små bitar. Den resulterande vävnaden fördes in i en 70 µm cellsil (BD, 352350) och bröts upp i en cirkulär rörelse med den räfflade toppen av en sprutas kolv. RPMI 1640 fördes sedan genom silen. Den sönderdelade vävnaden överfördes till 50 ml rör (Sarstedt, Barcelona, Spanien, 62.547.254) och centrifugerades vid 100 g under 10 min. Supernatanten innehållande cellsuspensionen uppsamlades sedan och centrifugerades igen vid 300 g under 10 min. Den resulterande supernatanten avlägsnades och pelleten återsuspenderades i 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1% FBS för att räkna antalet celler under mikroskopet, varefter den återcentrifugerades vid 300 g under 5 minuter. Endast 500,000 celler per prov användes. Varje prov återsuspenderades sedan i 50 µL blockerande buffert före färgning för flödescytometri.
4.3.3. Extracellulär flödescytometrifärgning
Tabell 2. Antikroppar och reagens som används för flödescytometrianalys.
4.4. Immunhistokemi
Möss sövdes djupt och perfuserades intrakardialt med saltlösning {{0}},9 % (vikt/volym). Deras hjärnor samlades in och efterfixerades med 4% paraformaldehyd i 24 timmar. Efter efterfixering, kryoskyddades de med 30% sackaros och frystes vid -20 ◦C tills sektionering. Vävnadssektioner (20 µm) skars ut med en kryostat (ThermoFisher, Microm™ HM550), tinades upp på Superfrost Plus-objektglas (ThermoFisher, J1800AMNZ) och förvarades slutligen vid -20 ◦C tills färgning. Immunhistokemisk färgning av vävnadssnitt utfördes som beskrivits tidigare [67]. Primära och sekundära antikroppslösningar späddes i 1 x PBS med 1 % BSA. Sektionerna inkuberades med den primära antikroppen anti-kanin Iba-1 (1:500 spädning; Wako Chemicals, Barcelona, Spanien, 019-19741). Alexa Fluor 488-konjugerad get-anti-kanin IgG (1:2000 spädning; ThermoFisher, Madrid, Spanien, A11031) användes som den sekundära antikroppen. Lämplig positiv kontrollvävnad inkluderades, såväl som primära och sekundära negativa kontroller. Fluorescerande märkningsbilder förvärvades med en ZEISS Apotome. 2 mikroskop med en axiom 503 mono digitalkamera och Zen Blue kontrollprogramvara version 2.3 (Carl Zeiss). Ett 10× objektiv (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR) användes för att visualisera hippocampus. Den integrerade densiteten inom de intressanta regionerna beräknades med ImageJ-mjukvaran. Denna parameter motsvarar summan av intensitetsvärdena för varje pixel i det valda området. Därför används den för att kvantifiera antalet celler som färgas i kombination med färgningsintensiteten för varje cell.
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
4.5. Western blot-analys
Mushjärnor avlägsnades snabbt och hippocampi dissekerades omedelbart och frystes. Vävnad bereddes med användning av en hyperton lysbuffert innehållande proteashämmare som tidigare beskrivits [68]. De primära antikropparna som användes var anti-kanin fosfor-IKK / (1:1000 spädning; Cell Signaling, Alcobendas, Spanien, 2861), anti-kanin IKK / (1:1000 spädning; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland, sc{{ 9}}), anti-kanin fosfor-STAT3 (1:1000 spädning; Cell Signaling, 9145) och anti-mus STAT3 (1:1000 spädning; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Anti-mus-tubulin (1:2000 spädning; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) användes som en laddningskontroll. Anti-kanin HRP (1:5000 spädning; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA, 111-035-144) och anti-mus HRP (1:5000 spädning; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003) användes som sekundära antikroppar . Proteinbandkvantifiering utfördes genom banddensitometrianalys med NIH ImageJ Software (version 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, tillgänglig den 1 mars 2022). För att säkerställa lika belastningar uttrycktes den integrerade densiteten som erhölls för varje band som ett relativt värde med avseende på lämplig hushållsbelastningskontroll.
4.6. Statistisk analys
Resultaten analyserades statistiskt med programvaran GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Data presenteras som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM) för generellt fyra oberoende experiment (n {{0}}–9). Efter att ha bekräftat normalfördelningen av data med Shapiro-Wilk-testet, bestämdes statistisk signifikans mellan de två grupperna med Student t-test för parametriska data. Skillnader ansågs vara statistiskt signifikanta när sannolikhetsvärden (p) var mindre än 0.05 (*), 0,01 (**) eller 0,001 (***). Figurer visar representativa experiment.
5. Slutsatser
Sammanfattningsvis indikerar våra resultat att underlåtenhet att inaktivera GSK3 genom Ser389-fosforylering leder till kronisk inflammation och endotoxintolerans och att hämningen av GSK3 av Ser9 och Ser389-fosforylering spelar komplementära och inte överflödiga roller i det neuroimmuna svaret. Därför bör de specifika konsekvenserna av GSK3 Ser389-fosforylering för neuropatologi och hjärnans åldrande undersökas.
Referenser
1. Souder, DC; Anderson, RM Ett expanderande GSK3-nätverk: Implikationer för åldrandeforskning. Gerovetenskap 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]
2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Krav på glykogensyntaskinas-3 i cellöverlevnad och NF-KB-aktivering. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]
3. Jope, RS; Johnson, GV Glykogensyntaskinasens glamour och dysterhet-3. Trender Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [CrossRef]
4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; Trä, CD; Aronshtam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; et al. Fosforylering av p38 MAPK som en alternativ väg för GSK3beta-inaktivering. Science 2008, 320, 667–670. [CrossRef]
5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Reglering av GSK3 genom Ser 389-fosforylering under neural utveckling. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]
6. Thornton, TM; Hare, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Failure to Inactivate Nuclear GSK3 by Ser 389-Fosforylering leder till fokal neuronal död och förlängd rädsla. Neuropsykofarmakologi 2018, 43, 393–405. [CrossRef] [PubMed]
7. Hare, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; King, SB; Jaworski, DM; Falls, WA Två veckors variabel stress ökar gamma-H2AX-nivåerna i musbäddskärnan i stria terminalis. Neurovetenskap 2018, 373, 137–144. [CrossRef]
8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Krementsov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; et al. Inaktivering av nukleär GSK3beta genom Ser (389)-fosforylering främjar lymfocyternas kondition under DNA-dubbelsträngbrottssvar. Nat. Commun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]
9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Necroptosis och dess roll i inflammation. Naturen 2015, 517, 311–320. [CrossRef]
10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Stressad och inflammerad, kan man skylla på GSK3? Trender Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [CrossRef]
11. Beutler, B.; Rietschel, ET Medfödd immunförnimmelse och dess rötter: historien om endotoxin. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]
12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Dynamisk modulering av medfödd immunsvar genom att variera doser av lipopolysackarid (LPS) i humana monocytiska celler. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [CrossRef]
13. Lu, YC; Ja, WC; Ohashi, PS LPS/TLR4 signaltransduktionsväg. Cytokine 2008, 42, 145-151. [CrossRef] [PubMed]
14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, SY GSK3-hämmande peptid skyddar möss från LPS-inducerad endotoxinchock. Immunnät. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]
15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL Revisiting the Roll of GSK3, A Modulator of Innate Immunity, in Idiopathic Inclusion Body Myosit. Cells 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]
16. Vines, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Ny antiinflammatorisk roll för glykogensyntaskinas-3beta vid hämning av tumörnekrosfaktor-alfa- och interleukin-1beta-inducerat inflammatoriskt genuttryck. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [CrossRef]
17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: A Kinas Balancing Promotion and Resolution of Inflammation. Cells 2020, 9, 820. [CrossRef]
18. Beurel, E.; Jope, RS Lipopolysackarid-inducerad interleukin-6 produktion kontrolleras av glykogensyntaskinas-3 och STAT3 i hjärnan. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]
19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. Glykogensyntaskinas-3-inaktivering hämmar produktion av tumörnekrosfaktor i mikroglia genom att modulera signalkaskader av kärnfaktor κB och MLK3/JNK. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]
20. Priego, N.; Valiente, M. Astrocyternas potential som immunmodulatorer i hjärntumörer. Främre. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]
21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Microglia och astrocytinblandning i neurodegeneration och hjärncancer. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]
22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Minskad nukleär beta-catenin, tau-hyperfosforlation och neurodegeneration i GSK-3beta-beta-konditionella transgena möss. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]
23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; et al. Hämning av Gsk3b minskar Nfkb1-signalering och räddar synaptisk aktivitet för att förbättra Rett-syndromets fenotyp i Mecp2-knockoutmöss. Cell. Rep. 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]
24. Martin, M.; Rehani, K.; Jope, RS; Michalek, SM Toll-liknande receptormedierad cytokinproduktion regleras differentiellt av glykogensyntaskinas. Nat. Immunol. 2005, 6, 777–784. [CrossRef]
25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Mekanismer och terapeutiska implikationer av GSK-3 vid behandling av neurodegeneration. Cells 2021, 10, 262. [CrossRef]
26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doxaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Kinaset Akt1 kontrollerar makrofagsvaret på lipopolysackarid genom att reglera mikroRNA. Immunitet 2009, 31, 220–231. [CrossRef]
27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL -13 orkestrerar upplösning av kronisk tarminflammation via fosforylering av glykogensyntaskinas-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [CrossRef]
28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glykogensyntaskinas-3beta är associerat med Parkinsons sjukdom. Neurosci. Lett. 2009, 449, 103–107. [CrossRef]
29. Nadri, C.; Kozlovsky, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. GSK-3-parametrar i lymfocyter hos schizofrena patienter. Psychiatry Res. 2002, 112, 51–57. [CrossRef]
30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glykogensyntaskinas-3 (GSK3): Inflammation, sjukdomar och läkemedel. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [CrossRef]
31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernandez, M.; Tranque, P. Dissociation av neonatala och vuxna möss hjärna för samtidig analys av mikroglia, astrocyter och infiltrerande lymfocyter genom flödescytometri. IBRO Rep. 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]
32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. En optimerad metod för att bearbeta mus CNS för att samtidigt analysera neurala celler och leukocyter genom flödescytometri. J. Neurosci. Metoder 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]
33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG En immunaffinitetsbaserad metod för isolering av ultrarena vuxna astrocyter baserad på ATP1B2-inriktning av ACSA-2-antikroppen. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]
34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Användningen av flödescytometri för att utvärdera temporala förändringar i inflammatoriska celler efter fokal cerebral ischemi hos möss. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovic, J.; et al. Anti-ACSA-2 definierar en ny monoklonal antikropp för prospektiv isolering av levande neonatala och vuxna astrocyter. Glia 2017, 65, 990–1004. [CrossRef]
36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Genuttrycksanalys av astrocyter och mikroglia endocannabinoid signalering under autoimmun demyelinisering. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]
37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh mogna och Ly6Gint omogna neutrofiler bidrar till utrotning av S. pneumoniae. J. Exp. Med. 2017, 214, 1333–1350. [CrossRef]
38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Chew, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; et al. Immunhistokemisk poängsättning av CD38 i tumörmikromiljön förutsäger känslighet för anti-PD-1/PD-L1-immunterapi vid hepatocellulärt karcinom. J. Immunother. Cancer 2020, 8, e000987. [CrossRef]
39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Yoshimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B undertrycker lipopolysackarid (LPS)-inducerad inflammation i mushjärnan. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [CrossRef]
40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madonna, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; et al. Roll av neuroinflammation i hypertoni-inducerad hjärna amyloid patologi. Neurobiol. Åldrande 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]
41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS aktiverar neuroinflammatoriska vägar för att inducera depression vid Parkinsons sjukdomsliknande tillstånd. Främre. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4
2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Neurala och beteendemässiga svar på låggradig inflammation. Behav. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]
43. Kang, J.; Park, D.; Shah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolysackaride inducerar neurogliaaktivering och NF-KB-aktivering i hjärnbarken hos vuxna möss. Labb. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]
44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Litium förbättrar lipopolysackarid-inducerad neurotoxicitet i cortex och hippocampus i den vuxna råtthjärnan. Neurochem. Int. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]
45. Paxinos, G.; Franklin, KB Mushjärna i stereotaktiska koordinater. 2001. Tillgänglig online: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (tillträde den 1 mars 2022).
46. Bronte, V.; Pittet, MJ Mjälten i lokal och systemisk reglering av immunitet. Immunitet 2013, 39, 806–818. [CrossRef]
47. Liu, T.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-KB-signalering vid inflammation. Signalöverföring. Mål. Ther. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]
48. Balic, JJ; Albargy, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, N.; Louis, C. STAT3 serinfosforylering krävs för TLR4 metabolisk omprogrammering och IL-1 uttryck. Nat. Commun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]
49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Wnt-poolen av glykogensyntaskinas 3beta är avgörande för neuronal död inducerad av trofisk deprivation. Mol. Cell. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [CrossRef]
50. Eom, T.; Jope, RS Blockerad hämmande serin-fosforylering av glykogensyntaskinas-3 / försämrar proliferation av neurala prekursorceller in vivo. Biol. Psykiatri 2009, 66, 494–502. [CrossRef] 5
1. Franceschi, C.; Campisi, J. Kronisk inflammation (inflammation) och dess potentiella bidrag till åldersrelaterade sjukdomar. J. Gerontol. Ser. En Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]
52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA En roll för omogna myeloidceller i immunåldring. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]
53. Tang, Y.; Le, W. Differentiella roller för M1 och M2 mikroglia i neurodegenerativa sjukdomar. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]
54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Systemisk inflammation och mikroglialaktivering: Systematisk översyn av djurförsök. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]
55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Hjärnregionberoende heterogenitet och dosberoende skillnad i övergående mikrogliapopulationsökning under Lipopolysackarid-inducerad inflammation. Sci. Rep. 2018, 8, 2203. [CrossRef]
56. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Hjärnregionsspecifik mikroglial och astrocytisk aktivering som svar på systemisk exponering av lipopolysackarider. Främre. Åldrande neurosci. 2022, 14, 910988. [CrossRef]
57. Radulovic, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, B.; Steinert, A.; Niess, JH Injektioner av lipopolysackarid i möss för att efterlikna inträde av mikrobiellt härledda produkter efter tarmbarriärbrott. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]
58. Fink, MP Djurmodeller av sepsis. Virulens 2014, 5, 143–153. [CrossRef]
59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Roll av endotelial TLR4 för neutrofilrekrytering till mikrokärl i centrala nervsystemet vid systemisk inflammation. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [CrossRef]
60. Beurel, E. HDAC6 reglerar LPS-tolerans i astrocyter. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]
61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Skyddande effekter av endotoxintolerans på perifer lipopolysackarid-inducerad neuroinflammation och dopaminerg neuronal skada. Immunopharmacol. Immunotoxikol. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Tumörnekrosfaktor inducerar GSK3-kinasmedierad korstolerans mot endotoxin i makrofager. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]
63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Phospholipase C-relaterat katalytiskt inaktivt protein reglerar lipopolysackarid-inducerad hypotalamus inflammation medierad anorexi hos möss. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]
64. Shah, SA; Khan, M.; Jo, M.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Melatonin stimulerar SIRT 1/Nrf2-signalvägen som motverkar lipopolysackarid (LPS)-inducerad oxidativ stress för att rädda postnatal råtthjärna. CNS Neurosci. Ther. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]
65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Kinetik av proinflammatoriska cytokiner efter intraperitoneal injektion av tribromoethanol och en tribromoethanol/xylazin-kombination i ICR-möss. Labb. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]
66. Posel, C.; Möller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från den ischemiska mushjärnan. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]
67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Respons av transkriptionsfaktor NFATc3 på excitotoxiska och traumatiska hjärnförolämpningar: Identifiering av en subpopulation av reaktiva astrocyter. Glia 2011, 59, 94–107. [CrossRef]
68. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Selenoprotein S uttryck i reaktiva astrocyter efter hjärnskada. Glia 2011, 59, 959–972. [CrossRef]
