HPLC-fingeravtryck och spektrum-antitumöreffektförhållande för diskriminering mellan Mylabris Phalerata Pallas och Mylabris Cichorii Linnaeus

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi, Kina,

2 Nyckellaboratorium för grundläggande farmakologi vid utbildningsministeriet och Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine vid utbildningsministeriet, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou, Kina.

3 School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, Kina, 4Guizhou Provincial College-baserade Key Lab for Tumour Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi, Kina.

Klicka här för att få mer information om Cistanche antitumör

Höjdpunkter

Denna studie ger en tillämplig, trovärdig och effektivare HPLC-metod för att urskilja två Mylabris-arter. Och HPLC-fingeravtryck och spektrum-antitumöreffekterintegrerades och de tre viktiga differentialmarkörerna hittades för en ny markör för Mylabris.

Abstrakt

Mål: Utvärdering av diskriminering mellan två Mylabris-arter baserat på HPLC-fingeravtryck och spektrum-antitumöreffektrelation. Metoder: I denna studie, en enkel och effektiv högpresterande vätskekromatografi (HPLC) metod integrerad med kemometrisk analys och spektrum-antitumöreffektförhållande utvecklades för diskriminering mellan två arter av Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) och Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Resultat: I fingeravtrycksanalysen valdes 14 karakteristiska toppar ut för att bedöma skillnaderna mellan MP och MC med hjälp av likhets- och mönsterigenkänningsanalysen med PCA och OPLS-DA. HPLC-kromatogrammen av prover från 10 regioner i Kina visade skillnader mellan MP och MC, och 7 karakteristiska kemiska markörer hittades. I spektrumet-antitumöreffektrelationsanalys, 4 aktivitetsmarkörer spelade en viktig roll för att minska IC50 och kan vara antitumörkomponenterna i Mylabris genom grå relationsanalys och multivariat linjär regressionsanalys. Den kemometriska analysen i kombination med spektrum-effektsambandsresultat visade att topparna 2 (cytosin), 4 (okänt) och 14 (okänt) var viktiga differentialmarkörer för att skilja de två arterna av Mylabris.

Slutsats: Metoden är tillämpbar, trovärdig och effektivare för att diskriminera MP och MC, och kommer att erbjuda ett nytt sätt att underlätta kvalitetskontroll av insektsläkemedel.

Nyckelord: HPLC, Fingerprinting, Spectrum-antitumöreffekt, Mylabris, Diskriminering

Bakgrund

Mylabris, kallad ban mao i Kina, har använts som traditionell kinesisk medicin (TCM) för behandling av furunkel, djuprotade sår, en bukmassa, och är en viktigantitumörombud. Dessutom används det flitigt i Europa som folkmedicin [1]. Den huvudsakliga aktiva beståndsdelen i Mylabris är kantaridin, som är en effektivanti-tumörförening [2]. Moderna farmakologiska studier har visat att Mylabris har flera aktiviteter och är högt värderad för behandling av tumörer på grund av dess dubblaanti-canceregenskaper och förmågan att öka antalet leukocyter [3-4]. För närvarande har Mylabris använts i stor utsträckning i vissa kliniska anti-karcinom TCM-recept i Kina, såsom Aidi-injektion och Compound ban mao-kapsel.

Enligt Folkrepubliken Kinas farmakopé (version 2015) definieras Mylabris som en torkad kropp av Mylabris phalerata Pallas (MP) och Mylabris cichorii Linnaeus (MC), som skiljer sig åt i sina botaniska egenskaper, populationsdynamik och ekologi [ 5-6]. Mylabris är också ett mycket giftigt läkemedel. Eftersom de läkemedel som finns tillgängliga i Kina vanligtvis är en blandning av MP och MC, är det nödvändigt att identifiera de kemiska skillnaderna och aktivitetsskillnaderna mellan de två arterna.

Eftersom TCM innehåller många kända och okända ingredienser, utgör kvantitativ profilanalys av deras kemiska beståndsdelar en betydande utmaning. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) fingeravtryck spelar en viktig roll i kvalitetskontrollen (QC) av TCM på grund av dess övergripande profilegenskaper för de flesta föreningar i ett komplext system. Vidare har fingeravtrycksanalys av TCM:er god reproducerbarhet och stabilitet för artautentisering och kvalitetsutvärdering, och accepteras av Världshälsoorganisationen, den statliga livsmedels- och läkemedelsmyndigheten i Kina (SFDA) och den europeiska läkemedelsutvärderingsbyrån (EMEA). Nyligen har en kemometrisk analys som kombinerar HPLC-fingeravtryck utvecklats för QC och urskiljning av olika komplexa naturliga källor [7]. Det är dock ineffektivt att särskilja skillnaderna i TCM eftersom det inte kan återspegla skillnaderna i aktiva beståndsdelar, vilket är viktigare för klinisk användning. Hittills har spektrum-antitumör effektrelationsmetoder har använts för att framgångsrikt identifiera de bioaktiva beståndsdelarna i TCM [8]. HPLC-fingeravtryck kombinerat med kemometrisk analys och spektrum-antitumöreffektförhållande kommer bättre att belysa skillnaden mellan flera källor till TCM.

Nyligen har några metoder rapporterats för att bestämma innehållet av cantharidin, som kan användas för att bestämma kvaliteten på Mylabris [9]. Vissa kromatografiska fingeravtryck användes också för QC [10-11]. Endast en studie använde en metod som involverade en gradienteluering av de vattenlösliga föreningarna av Mylabris baserad på HPLC. Under tiden användes endast tio prover och inga MC-prover [12]. Så vitt vi vet har diskriminerande MP och MC baserat på kemisk sammansättning och aktivitet inte studerats tidigare.

Denna studie syftade till att utveckla en enkel och effektiv metod för att skilja två arter av Mylabris med hjälp av HPLC-fingeravtryck kombinerat med kemometrisk analys och spektrum-antitumöreffektrelation, som kommer att utgöra en grund för QC av Mylabris. Denna metod kan också användas för att identifiera QC-markören för andra TCM.

Material och metoder

Totalt samlades 20 partier av Mylabris phalerata Pallas (MP) och Mylabris cichorii Linnaeus (MC) från olika provinser i Kina (tabell 1) och identifierades av vår prof Xiao-Fei Li. Verifikationsproverna deponerades i våra labb.

Referensstandardcytosin, uridin, guanosin och adenosin köptes från ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Acetonitril och metanol av HPLC-kvalitet köptes från Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). Watsons rena vatten användes under hela studien. Andra kemikalier och lösningsmedel var av analytisk kvalitet och erhölls från Aladdin Reagent (Shanghai, Kina), Chengdu Kelong Reagent (Chengdu, Kina) och Sinopharm Chemical Reagent (Peking, Kina)

Apparatur och kromatografiska förhållanden

HPLC-analysen utfördes med ett Agilent 1260 Infinity HPLC-system vid 30 grader på en Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) för fingeravtryck. Linjär gradienteluering med elueringsmedel A (vatten/isättika, 100:1, v/v) och B (metanol) användes för separation. Gradientprogrammet utvecklades enligt följande: 0-1 min, 3.0-4,6 procent B; 1-9 min, 4.6-6,8 procent B; 9-25 min, 6.8-51,0 procent B; 25-30 min, 51,0-100 procent . Flödeshastigheten för den mobila fasen var 1,0 ml/min. Kromatogrammet övervakades vid 254 nm. Efter en 15 minuters jämviktsperiod användes 10 μL prover för injektion.

Provberedning

De torkade proverna krossades till pulver och 2,5 g av varje pulveriserat prov extraherades två gånger med 50 ml 75 procent etanol genom återloppskokning i 1,5 timmar varje gång. Det extraherade provet blandades och koncentrerades under reducerat tryck till 20 ml. Blandningen fälldes sedan ut med 80 ml vatten i 24 timmar under 4 grader. Därefter centrifugerades extraktet vid 3000 g min -1 under 10 min för att separera supernatanten. Supernatanten koncentrerades under reducerat tryck till 25 ml. Slutligen filtrerades supernatanten genom en 0,22 μm Millipore-film före HPLC-analys.

Metodvalidering

HPLC-metoden validerades för precision, reproducerbarhet och stabilitet (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h) . Valideringen uppskattades baserat på retentionstiden (RT) och topparean (PA). Slutligen upprättades kemiska fingeravtryck av 20 partier Mylabris för att identifiera de integrerade kemiska egenskaperna hos flera föreningar. Vissa kemometriska tekniker introducerades på det kemiska fingeravtrycket för analys.

Analys av mönsterigenkänning

Skillnader mellan två arter av toppareorna utvärderades för statistisk signifikans med hjälp av oparat Students t-test. Ett p-värde mindre än 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Som en klassisk oövervakad metod används principal component analysis (PCA) allmänt för statistisk dataanalys. Istället för att använda många variabler tar PCA ett litet antal datorer utan att förlora mycket information, och poängdiagram visualiseras sedan för fri separation av observationer. I denna studie utfördes PCA på de normaliserade toppareorna för varje komponent i HPLC-fingeravtrycken med hjälp av SIMCA-P plus 14.0-mjukvaran (Umetrics, Umeå, Sverige) för att hitta diskrimineringen mellan de två arterna av Mylabris.

För mer föredragen diskriminering mellan de två Mylabris-arterna användes en övervakad metod för ortogonal partiell minsta kvadraters diskriminantanalys (OPLS-DA) för att analysera skillnaderna i de normaliserade toppareorna för varje komponent i HPLC-fingeravtrycken. VIP-värdet är en viktad summa av kvadrater av OPLS-vikterna, vilket återspeglar det relativa bidraget från varje X-variabel till modellen. Variablerna med VIP > 1, tillsammans med S-plot, ansågs vara inflytelserika för separeringen av prover i poängplotterna genererade från OPLS-DA-analys. Därefter erhölls de karakteristiska kemiska markörerna för diskriminering.

Analys av spektrum-antitumöreffektsamband

Att utforskaanti-tumörpåverka topparea för Mylabris-prover integrerade med fingeravtrycksdata, och jämföra skillnaderna mellan de två arterna, korrelationen mellan toppen av fingeravtrycket ochanti-tumöreffekter studerades. Två metoder som kombinerar grå relationsanalys och multivariat linjär regressionsanalys (MLRA) tillämpades av SPSS19.0 (IBM, USA) och GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Kina). Deanti-tumörtestet utfördes med våra publicerade metoder [12], humana hepatocellulära karcinomcellinjer HepG2-celler hölls i RPMI1640-medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum. Cellerna odlades i en fuktad atmosfär innehållande 5 procent CO2 vid 37 C. SRB-metod användes för att bedöma spridningen föranti-tumöraktiviteterIC50 för HepG2-celler beräknades, slutligen användes IC50 och normaliserade toppareor för kemometrisk analys. Sedan fick de karakteristiska aktivitetsmarkörerna för Mylabris.

Resultat och diskussion

Optimering av extraktförhållanden

För tillräcklig extraktion av vattenlösta föreningar från Mylabris optimerades extraktionssystemet. Ultraljud och refluxing visade att dessa föreningar kunde extraheras optimalt genom refluxing.

Optimering av HPLC-metoden

För att erhålla maximala kromatografiska toppar för att beskriva örtens övergripande egenskaper undersöktes sammansättningen av den kromatografiska kolonnen, mobilfas och detektionsvåglängder (200, 254, 265 och 278 nm). Resultaten visade att Phenimenex Synergy Polar-RP80-kolonn, vatten (innehållande 1 procent isättika) och metanol och 254 nm var de bästa förutsättningarna för Mylabris HPLC-analys (Figur 1), strukturen av 4 standardämnen visas i Figur 2 .

Metodvalidering

I denna studie var 14 toppar väl separerade och användes som "vanliga toppar". Precisionen, repeterbarheten och stabiliteten baserades på retentionstiden (RT) och topparean (PA). RSD-värdena för RT och PA för precision (n=6) översteg inte 0.2 respektive 4 procent; RSD-värdena för RA och PA för repeterbarhet (n=6) var under 0,2 respektive 4 procent, och RSD-värdena för stabilitet (0-24 h) var mindre än { {10}}.4 respektive 5 procent, vilket indikerade att proverna var stabila inom 24 timmar. Dessa resultat illustrerade att kvaliteten på de studerade proverna och HPLC-metoden var stabila och välkontrollerade.

Utvärdering av likhet med fingeravtryck

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 förutom MC-prover (från Guizhou2 och Guizhou4), vars likheter var 0.888 respektive 0.887. Dessa data indikerade att kvaliteten på Mylabris inom en art var stabil. Likheterna mellan endast tre MP-prover jämfört med HPLC-referensfingeravtrycket var dock > 0.930; och likheterna mellan endast två MC-prover jämfört med referens-HPLC-fingeravtrycket var > 0,921. Dessa resultat visade att de två arterna av Mylabris var avsevärd variation i vissa toppområden.

Diskriminering av MP och MC genom analys av mönsterigenkänning

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, kan topparna 1, 2, 4, 7, 9, 12 och 14 vara de mest signifikanta variablerna för att skilja mellan de två arterna (Figur 6). Toppgruppen (1, 2, 4, 7, 9, 12 och 14) kan spela en viktig roll för att skilja mellan MP och MC som karakteristiska kemiska markörer.

Spektrum-effektsamband genom grå relationsanalys

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Spektrum-effektförhållande av MLRA

MLRA-modellen är den vanligaste modelleringsmetoden för att härleda förhållandets komplexitet mellan två eller flera variabler och ett svar som byggdes av följande formel

Där Y är det uppskattade värdet och representerar svaret; Xn är en oberoende variabel, b{{0}} är skärningen och bn är regressionskoefficienten för Xn. I denna studie användes MLRA för att fastställa fingeravtryckseffektivitetsrelationen mellan värdena för toppområdena i HPLC-fingeravtryck och IC50 för anti-HepG2, och sedan hitta möjliga antitumörkomponenter. Kollineringen av data hittades av en vanlig MLRA-modell, som är olämplig för att utforska korrelationen mellan Y (IC50) och X (PA). En PCA MLRA-modell användes för att studera sambandet mellan fingeravtryck och effekt, och de första sex datorerna med en kumulativ variansbidragsgrad: 91,068 procent valdes ut för analys. Slutligen upprättades följande ekvation enligt SPSS-utgången och datorerna: IC50=1.115864 plus （ 1.87268PA1- 699.722PA2 plus 25.7138PA3 - 24.1528PA4 plus 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 plus 2.95283PA7- 15.5305PA8 plus 13.0297PA9 plus 22.5683PA10 - 10.3462PA11 plus 123.762PA12 plus 31.0428PA{{0}{74}4) (R var 0,682, P <>

Integrerande analys av två Mylabris-arter

Experimentet visade att HPLC-fingeravtryck kunde användas för att återspegla de kemiska egenskaperna hos Mylabris. Likhetsalgoritmerna PCA och OPLS-DA användes för att hitta skillnaden mellan MC och MP. Toppgruppen (1, 2, 4, 7, 9, 12 och 14) definierades som karakteristiska kemiska markörer.

Dessutom visade sig både GRA och MLRA vara en tillfredsställande metod för ytterligare diskriminering. Integrering av GRA- och MLRA-analysresultaten, topparna 2, 4 och 14 som aktivitetsmarkörer för Mylabris bör vara ansvariga för antitumöreffekten, som kan vara den farmakodynamiska materialets grund för Mylabris.

De viktiga differentialmarkörerna definierades för toppen med karakteristiska kemiska och aktivitetsmarköregenskaper. Så, mellan MC och MP på HPLC-fingeravtryck efter spektrum-effekt relationsanalys, var topparna 2 (cytosin), 4 (okänt) och 14 (okänt) viktiga differentialmarkörer för skillnaderna mellan MP och MC som visas i figur 7.

Slutsats

Sammanfattningsvis, i den aktuella forskningen, föreslogs en HPLC-metod för kemisk fingeravtryck av MP och MC. Genom att kombinera HPLC-fingeravtryck, PCA och spektrum-effekt relationsanalys såsom GAS och MLRA, kunde de kemiska och farmakologiska egenskaperna hos två närliggande arter av Mylabris diskrimineras. Detta indikerade att föreningar från topparna 2(cytosin), 4 (okänt) och 14 (okänt) som viktiga differentialmarkörer spelade dominerande roller för att skilja mellan MP och MC. Strukturen av topparna 4 och 14 bör identifieras med annan teknik. Metoden för HPLC-fingeravtryck i kombination med statistisk, kemometrisk analys och analys av spektrum-effektsamband visade sig vara effektiv för att upptäcka markörkomponenter eller för att främja QC avväxtbaserade läkemedel.

Referenser

1 Wang GS. Medicinsk användning av Mylabris i det antika Kina och nyare studier. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, et al. Bestämning av kantaridininnehåll och dess hämmande effekt på humana hepatom HepG2-celler. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, et al. Acyl-CoA: kolesterol acyltransferashämmande aktiviteter av fettsyraamider isolerade från Mylabris-falerat Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Day RM, Harbord M, Forbes A, et al. Cantharidinblåsor: en teknik för att undersöka leukocythandel och cytokinproduktion vid inflammationsställen hos människor. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Studie på föredragen föda av vuxna Mylabris phalerata i olika geografiska populationer. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Biologiska egenskaper hos Meloidae och dess konstgjorda utfodring. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Kvantitativ analys i kombination med fingeravtrycksteknik och kemometrisk analys tillämpad för att utvärdera sex arter av vilda Paris med UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, et al. Övervakning och utvärdering av kvalitetskonsistensen av Compound Vismut Aluminate-tabletter genom en enkel kvantifierad fingeravtrycksmetod kombinerad med samtidig bestämning av fem föreningar och korrelerad med antioxidantaktiviteter. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analys av cantharidin i falska blåsbaggar (Coleoptera: Oedemeridae) genom headspace fastfasmikroextraktion och gaskromatografi-masspektrometri. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Studie på GC-fingeravtrycken av Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX och Shi XF. Digitaliserade fingeravtryck av Mylabris av HPCE. Central South Pharmacy (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX och Wang, Z. Studie av Mylabris digitaliserade HPLC-fingeravtryck. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Anti-humant hepatocellulärt karcinom HepG 2-cellsaktivitet av kantaridin härrörande från Guizhou-provinsen och omgivande regioner. Journal of Modern Medicine & Health (Chin) 2016; 32(5): 648-650.