Mitokondriella proteiner avslöjar mekanismen genom vilken fysisk träning förbättrar minne, inlärning och motorisk aktivitet vid hypoxisk ischemisk encefalopati Råttmodell Del 3

4. Material och metoder

4.1. Djur och försöksgrupper

Trettiosex Sprague-Dawley-råttor användes för denna studie. Djuren hölls vid 22 ± 1◦C med ljus/mörker-cykler på 12 timmar och hade fri tillgång till mat och vatten. Experimentella förfaranden genomfördes med godkännande av Ethical InstitutionalCommittee on Animal Care and Research vid Zhengzhou University.

Den mörka cykeln hänvisar till den period då människor sover på natten, och det är nära relaterat till minnet. För de flesta förbättrar en god natts sömn den fysiska hälsan och hjärnans funktion. Samtidigt är sömn också relaterad till hjärnans minnesprocess.

När vi sover går våra kroppar in i olika sömnstadier, inklusive snabb ögonrörelse (REM) sömn och icke-snabb ögonrörelse (NREM) sömn. Dessa stadier spelar en viktig roll för att reglera hjärnans informationsintegration och minneskonsolidering.

De flesta upplever de positiva effekterna av sömn på koncentration och minne. Forskning visar att sömn kan hjälpa oss att konsolidera och stärka våra minnen och till och med förbättra vår förmåga att lära. Under sömnen integrerar hjärnan ny information med befintlig kunskap och förbättrar därigenom förmågan att lagra och använda minne.

Omvänt kan brist på tillräcklig sömn leda till minnesförlust och inlärningssvårigheter. Långvarig sömnlöshet kan orsaka en mängd olika problem i kroppen och hjärnan, vilket påverkar det dagliga livet och arbetsförmågan. Därför är en korrekt sömnstrategi och en rimlig livsstil avgörande för att behålla ett bra minne.

Sammantaget finns det ett samband mellan mörka kretslopp och minne. Tillräcklig sömn kan främja integration av hjärninformation och minneskonsolidering, medan långvariga sömnstörningar kan påverka hjärnans funktion och minne. Därför bör vi vara uppmärksamma på sömnkvaliteten i vårt dagliga liv och upprätthålla en hälsosam livsstil, för att effektivt stödja och förbättra vårt minne och inlärningsförmåga. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt, eftersom Cistanche deserticola också kan reglera balansen av signalsubstanser, som att öka nivåerna av acetylkolin och tillväxtfaktorer. Dessa ämnen är mycket viktiga för minne och inlärning. Dessutom kan Cistanche deserticola också förbättra blodflödet och främja syretillförseln, vilket kan säkerställa att hjärnan får tillräckligt med näringsämnen och energi, och därigenom förbättra hjärnans vitalitet och uthållighet.

Klicka på vet 10 sätt att förbättra minnet

Alla ansträngningar gjordes för att minska antalet djur och minimera djurens lidande under experimenten. Djuren delades slumpmässigt in i fyra grupper (Figur 8). (1) HIE, NT (hypoxi-ischemiencefalopatigrupp utan träning) bestod av djur som modellerades för hypoxisk-ischemisk encefalopati på postnatal dag 7 genom att bedöva ungarna med isofluran (5 % induktion, 1,5 % underhåll).

Den vänstra gemensamma halspulsådern ligerades sedan permanent och ungarna lades på en varm återställningssoffa i 30 minuter innan de överfördes till en hypoxisk kammare med ett kontinuerligt flöde av den hypoxiska gasblandningen av 92 % N2 och 8 % O2 under 90 minuter och sedan återvände till burarna fram till den 10:e veckan utan att utsätta dem för simträning. (2) HIE, T (hypoxi-ischemi-encefalopatigrupp med träning) bestod av djur som modellerades för hypoxisk-ischemisk encefalopati som i (1) och som återvände till burarna fram till 6:e levnadsveckan och sedan utsatts för 90 min. simträning dagligen i fem dagar med 2 dagars vila per vecka i 4 veckor, (3) SHAM, NT (kontrollgrupp) inkluderade djur som inte utsatts för någon behandling men levde ett normalt liv i burarna från postnatal dag 1 till 10:e veckan utan träningsträning, och (4) SHAM, T bestod av djur som inte utsatts för någon behandling utan levde ett normalt liv i burarna från postnatal dag1 upp till 6 veckor, varefter de utsattes för simträning i 4 veckor.

Djurhjärnorna från de olika grupperna skördades sedan och förbereddes för western blotting (hippocampus och cerebral cortex) och immunfluorescens (motorisk cortex).

4.2. Övningsparadigm

Djuren hölls med mat och vatten ad libitum och hölls i en 12-ljus/mörkercykel. De delades in i två grupper: stillasittande djur (HIE, NT och SHAM, NT) och motionsdjur (HIE, T och SHAM, T). De motionerande djuren utsattes för simövningsträning efter postnatal vecka 6 under 4 veckor; de utsattes för simträning 5 dagar i veckan med 2 dagars vila. Varje simpass varade i 90 min. Poolen fylldes till ett djup av 50 cm för att förhindra att djuren vidrör botten av tanken.

Djuren fick simma fritt, utan någon extra belastning, och stimulerades försiktigt under simningen. Råttorna torkades försiktigt efter träningen och återvände till burarna.

4.3. Vertica! Polmotortest

Djuren i varje grupp placerades ett och ett med framsidan uppåt på en tygtejpbeklädd stång (3,0 cm i diameter och 150 cm längd), som hölls i horisontellt läge och lyftes sedan gradvis till en vertikal position, och tiden som råttan stannade på stolpen registrerades under maximalt 2 minuter (120 s). I detta test faller djuret med underskott i motorisk koordination och balans av stolpen.

4.4. Morris Water Maze Test (MWM)

Råttor (10 veckor gamla) utsattes för MWM efter att ha genomgått 4 veckors träningsprotokoll (SHAM, 'T och HlE, T). Alla data från vattenlabyrint registrerades med Panjab SMART videospårningssystem (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanghai, Kina). MWM användes enligt beskrivning av l32]. Kortfattat använde råttor visuella signaler placerade på gränsen till en pool för att nå en dold plattform och fly från vattnet. Lärandet bedömdes under 7 dagar. Innan inlärningsbedömningen introducerades råttor i poolen som innehöll klart vatten och en synlig plattform. Under träningen fick råttorna provsimövningar för att bli bekanta med uppgiften.

Under inlärningsfasen smetades råttor med svart färg för enkel videospårning och plattformen sänktes ned. Varje råtta utsattes för fyra försök från olika utgångspunkter (kvadranter). Latensen eller tiden som krävs för att nå plattformen registrerades varje dag av Panlab SMART Video Tracking System. På den sista dagen av experimentet avlägsnades plattformen och varje råtta återinfördes i vattnet antalet gånger djuren korsade platsen för den dolda plattformen i kvadranten som tidigare innehöll plattformen (målkvadranten) registrerades.

4.5. Western Blotting

Sex råttor valdes slumpmässigt ut från varje grupp för experimentet på proteinnivå. Proteiner extraherades från hippocampus och cortex och homogeniserades i RIPAs reagens (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) och separerades i cytoplasmiska och nukleära proteiner. Proteinkoncentrationerna bestämdes med hjälp av bicinchoninicacid-analysen (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA), och totalt 20 g protein separerades genom elektrofores på universella SDS-PAGE-geler (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Kina.

Proteiner överfördes sedan till polyvinylidenfluoridmembran, (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, USA). Membranen blockerades i 2 timmar med 5 % bovint serumalbumin (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Peking, Kina) vid rumstemperatur och inkuberades med följande primära antikroppar från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): AIF (D39D2, 1:1000), Cytokrom C (136F3, 1:1000), kluvet kaspas{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) och OPA1 (D7C1A, 1:1000).

GAPDH från Servicebio, Wuhan, Kina (GB11002, 1:2000) och H3 från Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) vid 4 ◦C över natten följt av HRP-konjugerad sekundärantikropp SA00001-2 från Proteintect (1:5000) inkubation i 2 timmar vid rumstemperatur. Proteinbanden visualiserades med ett förbättrat kemiluminescenskit #KF005 från Affinity Biosciences och avbildades med Bio-Image Analysis-systemet (Zhengzhou University, Zhengzhou, Kina). Förhållandena mellan proteinbandintensiteter och GAPDH (cytoplasmatiska proteiner) och H3 (nukleära proteiner) som interna referenser bestämdes med hjälp av ImageJ.

4.6. Immunfluorescens

De {{0}} µm koronala skivorna av hjärnvävnad erhölls med användning av en frysmikrotom (Leica, Tyskland) för immunfluorescens. Objektglasen blockerades i 2 timmar med PBS med 10 % fetalt bovint serum, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Beijing, Kina) och 0,3 % Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estland vid rumstemperatur och sedan inkuberade med primära antikroppar från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): anti-AIF, D39D2 (utspädning 1:400), anti-Cytokrom C, 136F3 (spädning 1:200), anti-klyvt kaspas-3 , Asp175 (spädning av 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (spädning av 1:200) och anti-OPA1, D7C1A (spädning av 1:400) över natten vid 4 ◦C.

Därefter tvättades objektglasen 3 gånger vardera på 10 minuter i PBS och inkuberades sedan med sekundära antikroppar (ab150077 från Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, Storbritannien) i 2 timmar vid rumstemperatur i mörker.DAPI, #C0065 från Solarbio Life Sciences, Beijing, Kina (1:100PBS) tillsattes i 5 minuter och hälldes av, tvättades i PBS i 3 gånger vardera 5 minuter, torkades, antisläckmedlet tillsattes (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina), glas Slips fixerades på objektglasen och prover lagrades vid -20 ◦C i 2 timmar och togs för mikroskopisk avbildning. Vävnadsbilderna togs med ett konfokalt fluorescensmikroskop (Ni-U942877, Nikon, Tokyo, Japan), och bilderna representerade proteinerna i den motoriska cortex kvantifierades sedan med FIJI-ImageJ som beskrivs i [33].

4.7. Statistisk analys

GraphPad Prism version 8.0.0 för Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) användes för alla analyser. Envägs ANOVA följt av Dunnetts post hoc-tester, respektive, användes för att mäta statistisk signifikans. Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM, och p < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.

5. Slutsatser

Denna studie visar att simträning förbättrade motorisk aktivitet, minne och inlärning i samband med HIE genom att undertrycka mitokondriell apoptos via signalvägarna Cyto.C/klyvda kaspas-3 och AIF. Dessutom har simträningsintervention visat sig stabilisera mitokondriella cristae och membranpotentialen som avbildas av omkastningen av Smac/Diablo och OPA1 hos råttor med HIE. Som ett resultat är detta en attraktiv och livskraftig grund för ytterligare forskning för att dechiffrera fler molekylära vägar som skulle kunna manipuleras för att effektivt hantera HIE och de resulterande underskotten. Även om denna studie framgångsrikt visade vilken roll träning spelar för att vända de strukturella och funktionella bristerna i mitokondrierna som orsakas av HIE uttömde den inte alla möjliga metoder för att fastställa hur mitokondriella kristaller stabiliseras; detta är avgörande för framtida forskning om detta ämne.

Författarbidrag: Conceptualization, FG, FP, YW och CC; datakurering, FG, FP, YW,HL och JF; formell analys, FG, HL och CC; finansieringsförvärv, CC; utredning, FG, FP, YW, HL och JF; metodik, FG, FP, YW och CC; projektadministration, FG, YW och CC; resurser, CC; mjukvara, FG, FP, JF och CC; övervakning, CC; validering, FG, FP, YW, HL och CC; visualisering, FG, FP, YW, HL och JF; skriva – originalutkast, FG och YW; skriva – granska och redigera FG och HL Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering: Den här studien stöds av det vetenskapliga och tekniska forskningsprojektet vid Henan Provincial Department of Science and Technology (bidrag nr. 212102310217) och ett anslag från theFunds of the National Natural Science Foundation of China (bidrag nr. 81401015).

Uttalande från institutionell granskningsnämnd: Studien genomfördes enligt riktlinjerna från kommittén för vård av forskningsdjur vid Zhengzhou University; ZZUIRB2022-32.

Informerat samtycke: Ej tillämpligt.

Datatillgänglighet: Ej tillämpligt.

Intressekonflikter: Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Hjärnimmuna interaktioner vid perinatal hypoxisk-ischemisk hjärnskada. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hypoxisk-ischemisk encefalopati: En recension för läkaren. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Svart, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al. Globala, regionala och nationella orsaker till barnadödlighet 2008: En systematisk analys. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Farmakologiska neuroprotektiva strategier vid neonatal hjärnskada. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Roll av apoptosinducerande faktor vid perinatal hypoxisk-ischemisk hjärnskada. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Song, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Löpbandsträning och hjulträning förbättrar den motoriska funktionen genom att undertrycka apoptotisk neuronal celldöd hos hjärninflammationsråttor. J. Exerc. Rehabil. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7. Kelly, M.; Darrah, J. Vattenträning för barn med cerebral pares. Dev. Med. Barn. Neurol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]

8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Lactate and BDNF: Key Mediators of Exercise Induced Neuroplasticity? J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cotman, CW Träning motverkar sjunkande hippocampus funktion vid åldrande och Alzheimers sjukdom. Neurobiol.Dis. 2013; i pressen. [CrossRef]

10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. BDNF-receptorblockad hindrar de gynnsamma effekterna av träning i en råttmodell av Parkinsons sjukdom. Neurovetenskap 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com