Oxidativ stress, dysfunktionell energimetabolism och destabiliserande neurotransmittorer förändrade den cerebrala metaboliska profilen i en råttmodell av simulerad heliox-mättnadsdykning till 4.0 MPa Ⅱ

Vävnadsextraktionsprocedur

Extraktionsproceduren för polära metaboliter från vävnadsprover var en mindre modifiering som rapporterats [18]. Förvägda frysta vävnadsprover tinades på is och utsattes sedan för mekanisk homogenisering i ett iskallt HPLC-kvalitets metanol-kloroform-vattenlösningsmedelssystem (400 μL, 400 μL respektive 285 μL per 100 mg hjärnvävnad) med en vävnadshomogenisator (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Frankrike). De resulterande homogenaten behölls på is under en period av 30 minuter och centrifugerades sedan vid 12, 000 xg under en period av 10 minuter vid 4 ˚C. Supernatanten från varje prov avlägsnades sedan och lyofiliserades för att erhålla ett pulver innehållande polära metaboliter i en frystork (FD-1A-80, BIOCOOL, Kina). Varje pulverprov rekonstituerades därefter med 550 μL PBS-buffert med 0,1 procent TSP, och alla prover roterades sedan noggrant och centrifugerades vid 12,000 xg under en period av 20 minuter vid 4˚C. En alikvot på 500 μL supernatant överfördes sedan till ett 5,0 mm-diameter NMR-rör (Norrel, Storbritannien). Extraktionsprincipen för protein i cortexprovet var som tidigare beskrivits utan några modifieringar. Den exakta mängden cortexprover hälldes i en homogeniseringsbuffert (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmol/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 procent Triton X-100, aprotinin, pepstatin A och leupeptin 10 ug/ml vardera) och homogeniserades manuellt i ett isbad. Blandningen centrifugerades vid 1,000 xg under en period av 10 minuter vid 4˚C, och supernatanten användes för de kvantifierade proteinkoncentrationerna med användning av Bradford-testet.

Klicka här för att veta Cistanche antioxidationsfunktion

Biokemisk analys

En känslig, kompetitiv enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) applicerades med analyskit för kvantifiering av de metaboliska enzymerna Na-KATPase och AChE och neurotransmittorerna DA, E, NE, 5HT och GABA. ELISA bestämde också nivåerna av SOD, MDA och GPx i kortikal vävnad med analyskit enligt tillverkarens instruktioner.

NMR-mätning

Den effektiva kvantifieringen av vävnadsmetaboliter uppnåddes med hjälp av en analytisk plattform baserad på en flytande högupplöst Bruker Avance-III NMR-spektrometer utrustad med en högkänslig kryogen sond som arbetar med en frekvens på 600. 17 MHz för 1 H observation vid 298 K. En vattendämpad endimensionell 1 H ZGPR (TOPSPIN version 3.0, Bruker Biospin) pulssekvens (RD-90˚-ACQ) applicerades på skaffa NMR-data för varje prov. Fyra dummy-skanningar och 128 transienter registrerades i en tidsdomän med 32 K datapunkter med användning av en spektral bredd på 20 ppm med en relaxationsfördröjning på 10,0 s och en insamlingstid på 2,73 s. En exponentiell linjebreddningsfunktion på 0,3 Hz och nollfyllning till 64 K datapunkter applicerades på alla fria induktionsavfall (FID) före Fourier-transformation. Ytterligare tvådimensionella NMR-tekniker med pulserad fältgradientkorrelationsspektroskopi (gCOSY) och 2D homonukleär totalkorrelationsspektroskopi (TOCSY) användes med hjälp av standardpulsprogram på utvalda prover för att bekräfta de kemiska skifttilldelningarna. En automatiserad provväxlare för kontinuerlig provleverans användes vid all spektraförvärvning.

Metabolitidentifiering och bekräftelse

NMR-signaler baserade på platsen för individuella resonanser på spektra identifierades i Chenomx NMR Suite v. 8.4 mjukvarupaket (Utvärderingsversion). Bekräftelserna av vissa metabolittilldelningar utfördes med hänsyn till kemiska förändringar, kopplingskonstanter och multiplicitetsmönster av metaboliter som information om skalära kopplingar extraherade från 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, offentliga NMR-databaser som COLMAR och Human Metabolome Databas (HMDB), och litteraturen [18, 19].

Multivariat statistisk analys

Förbehandlingsprotokollet som användes för att förbearbeta varje 1D 1H NMR-spektrum var detsamma som det som beskrivs i vårt tidigare arbete [20]. 1H NMR-spektra fasades och baslinjekorrigerades med MestReNova (Mestrelab Research, SL, Spanien), och den spektrala regionen för varje metabolit integrerades i en hink. Resonanserna för den organiska lösningsmedelssignalen och den kvarvarande H2O/HOD-signalregionen avlägsnades i alla 1D ^H NMR-spektra. En 0.{{30}}03 Hz hinkprocedur och normalisering till summan av den spektrala intensiteten multiplicerad med 10 000 tillämpades i alla spektra. Endast de största hinkvärdena i en topp valdes ut för nästa stegsanalys för att undvika feltolkning av de diskriminanta metaboliterna på grund av överlappande signaler. Därefter extraherades integrerade hinkar med 47 metaboliter och utsattes för univariat och multivariat dataanalys. Urskiljningsanalys genom principal komponentanalys (PCA) och diskrimineringsanalys genom partiell minsta kvadrat-diskriminerande analys (PLS-DA) och ortogonala projektioner till latenta strukturer diskriminantanalys (OPLS-DA) utfördes med hjälp av SIMCA-P plus 14.0 mjukvarupaketet (Umetrics) , Umeå, Sverige) skalad till enhetsvariansdata. PCA- och PLS-DA-poängdiagrammen illustrerades med den första och den andra huvudkomponenten (t[1], t[2]), medan OPLS-DA-poängdiagrammet använde t[1] och den ortogonala komponenten (till[1) ]). Parametrarna Q2 (cum), R2Y(cum) och R2X (cum) beräknades för att testa robustheten hos diskrimineringsmodellerna mot överanpassning [21]. Som tidigare beskrivits anses ett kvalitetsbedömningsvärde på Q2 � 0,4 vara en tillförlitlig modell. Den sjufaldiga korsvalideringsstrategin och permutationstestet 200 gånger med den första komponenten användes för att skydda mot modellöveranpassning och ytterligare validera modellernas tillförlitlighet och trovärdighet. Om Q2-regressionslinjen hade en negativ skärning och Q2-värdena inpassade i den vänstra punkten var större än alla Q2-värden för de högra punkterna i det permuterade testet, var den etablerade OPLS-DA-modellen robust [22]. Standardstrategin för 10-faldig korsvalidering användes för att skydda mot överanpassad modell. I allmänhet anses en kvalitetsbedömningsstatistik (Q2) � 0,4 vara en tillförlitlig modell, som tidigare beskrivits. Korrelationskoefficienterna (r) och VIP-värden extraherade från OPLS-DA-modellerna användes för att identifiera metaboliter som bidrog signifikant till separationen mellan de två grupperna. Dessutom beräknades veckförändringarna av metaboliter mellan grupper med hjälp av en funktion. IA/IB, där IA och IB representerar medelvärdena för metabolitintegralen i A- respektive B-grupperna. Värmekartan och boxdiagrammen ritades för att underlätta förståelsen av metabolitvariationerna mellan grupper.

Univariat statistik över metabolitintegraler

Hinkmedelvärdet av metaboliter i varje grupp uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD). Univariat analys utfördes också med användning av ANOVA (variansanalys). Statistiskt signifikanta skillnader mellan grupper utvärderades genom ett oparat t-test av två svansar efter loggkonvertering i programvaran GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). Statistiskt signifikanta skillnader definierades av värden på p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Systemstatistisk metabolisk korrelationsanalys och hierarkisk klusteranalys

Pearsons korrelationskoefficientberäkning och hierarkisk klusteranalys utfördes baserat på de relativa integralerna av metaboliter i R Studio (Version 1.4.1717) med små skript. För varje grupppar illustrerades korrelationsmatrisen i en pixelkarta som beskrivs i litteraturen [21]. Kortfattat, för varje variabel i en grupp, ansågs korrelationer med p-värden mindre än 0.05 signifikanta statistiska korrelationer och behölls för att konstruera det slutliga korrelationsnätverket för att illustrera de latenta förhållandena mellan metaboliter inom grupp och de störda metabola relationerna mellan grupper. De rödare rutorna indikerar en mer signifikant positiv korrelation. De blåare rutorna indikerar en mer signifikant positiv korrelation. De vita rutorna indikerar korrelationen utan betydelse. Analys av de mest relevanta cerebrala metaboliska vägarna och nätverken som åberopades som respondenter till HSD utfördes med hjälp av verktyget MetaboAnalyst 3.0. För den utförda vägtopologianalysen valdes Rattus norvegicus (råtta) däggdjursvägbibliotek. Detta tillvägagångssätt användes också för att ge uppskattningar av vägpåverkan, falsk upptäcktsfrekvens (FDR) och p-värden.

Resultat Kortikala biokemiska index från HSD- och CON-grupperna

För att validera de metaboliska förändringseffekterna av HSD på hjärnvävnaderna, biokemiska parametrar, inklusive de energimetabolismrelaterade metabola enzymatiska aktiviteterna av Na-KATP, AChE och LDH, neurotransmittorerna av DA, E, NE, 5HT och GABA, och deoxidativ stress-relaterade proteineravSOD, MDAoch Gpx i de ipsilaterala cortexvävnaderna hos HSD- och CON-råttor bestämdes också (tabell 1). Jämfört med kontrollgruppen ökade nivåerna av DA, E, NE och MDA signifikant, medan innehållet av Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD och Gpx minskade i HSD-modellen. Detektionsgränsen för analyskit som används i detta arbete listades i S3-tabellen i filen med kompletterande material.

Tabell 1. Kvantifieringen av biokemiska parametrar mättes i cortexvävnad CON och HSD-djur med ELISA med analyskiten. (medelvärde ± SD). indikerar statistisk signifikans.

Metaboliter identifierade i 'H NMR-spektra av hjärnvävnadsprover

Fig 3 visar tre representativa 'H NMR-spektra från cortex (fig 3A), hippocampus (fig 3B) och striatum (fig 3C) hos en HSD-råtta. Ett brett spektrum av framträdande metaboliter identifierades enligt 'H NMR-data från hjärnvävnadsprover, och de är organiska syraanjoner (laktat (Lac), malonat (Maln), succinat (Suc), malat (Mal), fumarat (FMA). ), 2-hydroxibutyrat (2-HB), acetat (Ace), formiat (For), taurin (Tau), askorbat(Asc), 2-hydroxibutyrat (2HIB)), aminosyror (leucin (Leu), isoleucin (Ile), valin (Val), alanin (Ala), glycin (Gly), tyrosin (Tyr), fenylalanin (Phe), aspartat (Asp), glutamin (Gln), glutamat (Glu) , treonin (Thr), serin (Ser), lysin (Lys), asparagin (Asn)), neurotransmittorer (-aminobutyrat (GABA)), energirelaterade metaboliter (kreatin (Cre), adenosintrifosfat (ATP), adenosinmonofosfat ( AMP)), fosfolipidrelaterade metaboliter (Ofosfoetanolamin (PEA), O-fosfokolin (Pcho), sn-glycero-3-fosfokolin (GPC)) och andra (myo-inositol (MI), nikotinamidadenindinukleotid (NAD plus) ), nikotinurinsyra (Nic), N-acetylaspartat (NAA), nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP plus ), UDP-N-galaktos (UDPGa), uridin (Uri), uracil (Ura), cystidin (Cyt) uridin 5'-monofosfat (UMP), inosin 5'-monofosfat (IMP), inosin (Ino), kolin (Cho), bilnitin (bil), glutation (GSH). S1 Tabell visar detaljerad information om metabolittilldelningarna.

Ändringar av metabolisk profil avslöjas genom metabolomisk analys

PCA, en utforskande och opartisk analysmetod av 1H NMR-spektra från alla hjärnextrakt över olika hjärnregioner, gjordes först för att avslöja de viktigaste metaboliska trenderna som drivs av hyperbar exponering för en 400 msw heliox-mättnadsmiljö. En PC1 vs. PC2 spridningsplot erhållen från PCA (S1A–S1C Fig) av integrerad hinkdata visade en viss diskriminering med viss överlappning mellan de två klassificeringarna. Övervakade undersökningar av PLS-DA (S1A'–S1C' Fig) och OPLS-DA (Fig 4A-4C) modeller uppvisade tydliga klassskillnader av de metaboliska profilerna mellan grupper. Fig. 4 visar poängdiagrammen för OPLS-DA-modellen för cortexregionen (A), hippocampusregionen (B) och striatumregionen (C), som visar tydlig diskriminering mellan HSD-grupperna och kontrollerna. Den höga förklarade variationen och godheten i förutsägelsen som återspeglas av värdena för R2X och Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig 4A-4C) och permutationstestplots (Fig 4'-4C'A) indikerade robustheten hos de genererade övervakade modellerna. Korrelationskoefficienten (r) extraherad från S-linjediagrammen, variabel betydelse vid projektion (VIP), och p-värdet från de icke-parametriska univariattesterna samlades in för att bedöma de signifikanta metaboliter som är ansvariga för de klass-diskriminerande mönstren. Därför, genom att uppfylla något av de tre kriterierna (det absoluta värdet på r större än 0.50, värdet på VIP större än 1,0, tillsammans med ett p-värde mindre än 0,05), valde vi därför ut en panel med statistiskt signifikanta metaboliter (Tabell 1) ansvarig för separationen mellan CON- och HSD-grupperna. I tabell 1 indikerar veckförändringsvärden större än 1 en ökad nivå i HSD-gruppen, medan fold-change-värden mindre än 1 indikerar en minskad nivå i HSD-gruppen. De genomsnittliga SD-värdena för diskriminerande metaboliter listas i S2-tabell. Med hjälp av den hierarkiska klusteranalysen av metaboliter och den genomsnittliga länkmetoden, möjliggör den genererade värmekartan (Fig 5A–5C) med dendrogram bättre visualisering av tre metaboliska förändringar i hjärnregionen orsakade av hyperbar exponering i en heliumsyremättad miljö.

Metaboliska störningar observerade i olika hjärnregioner hos HSD-råttor

Den ovan nämnda multivariata analysen och univariata analysen med användning av skophöjden för metaboliter i de olika grupperna gav ett bra arbetsrör för att identifiera diskriminerande metaboliter som avslöjar de potentiella neurologiska metaboliska förändringarna i samband med HSD-händelser. Förhöjda AMP, FMA, Nic och Phe och en minskning av Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura och Uri hittades i cortexvävnaden i HSD grupp jämfört med CON-gruppen (Fig 5A, Tabell 1). Under tiden, i hippocampus, minskade också Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr och Ura och AMP ökade i HSD-gruppen, som de gjorde i cortex. Dessutom uttrycktes den uppreglerade Thr och nedreglerade Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc och DMA i hippocampusextrakt från HSD-gruppen i förhållande till kontrollerna (Fig 5B, 5D, Tabell 1). Jämfört med CONS-gruppen minskade även innehållet av Cyt, GABA, Ura, Cho och Thr som de gjorde i cortex och hippocampus. Dessutom ökade nivåer av grenkedjiga aminosyror (BCAA, inklusive Leu, Ile, Val) och Lys och minskade nivåer av Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, en serie metaboliter av ATP, Tau, IMP, och Suc, som också minskade i hippocampus, och ytterligare två metaboliter, Ino och Pcho, som också minskade i cortex, observerades i striatumvävnaderna hos HSD-gruppråttor (Fig 5C, 5D, Tabell 1). Sådana många metaboliter indikerar alltid implicerade molekylära vägar med komplexitet och mångfald. De integrerade bucket-värdena för diskriminanta metaboliter kvantifierades, och statistiskt signifikanta förändringar av deras koncentrationer mellan heliox-mättnad-hyperbar-exponerade och kontrollgrupperna sammanfattas i S2 Tabell och Tabell 2 för de tre hjärnregionerna.

Fig 4. Ortogonala partiella minsta kvadraters diskriminantanalys (OPLS-DA) poängdiagram och permutationstestplots som särskiljer effekten av 400 msw heliox-mättnadsexponering på 1H NMR-spektra från kontrollgrupper i cortex (CONC, n=8, HSDC, n=8, A och A') (R2X=0.38; Q2=0.46), hippocampus (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B och B') (R2X=0.37; Q2=0.43), och striatum (CONS, n=8, HSDS, n=8, C och C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Värdena för Q2-parametern i OPLS-DA-poängdiagrammen, som var lika med eller större än 0,40, tillsammans med Q2-värdena för punkten längst till vänster i de permuterade modellerna var större än alla inpassade Q2-värden för de högra punkterna (permutation) test 80 gånger), vilket indikerar att de etablerade OPLS-DA-modellerna var giltiga.

Pcho, som också minskade i cortex, observerades i striatumvävnaderna hos HSD-gruppråttor (Fig 5C, 5D, Tabell 1). Sådana många metaboliter indikerar alltid implicerade molekylära vägar med komplexitet och mångfald. De integrerade bucket-värdena för diskriminanta metaboliter kvantifierades, och statistiskt signifikanta förändringar av deras koncentrationer mellan heliox-mättnad-hyperbar-exponerade och kontrollgrupperna sammanfattas i S2 Tabell och Tabell 2 för de tre hjärnregionerna.

Fig 5. Värmekarta och statistiska korrelationsdiagram härledda från bucket-värdena för de diskriminerande metaboliterna från cortex (A, A', HSDC-prover ligger i den övre panelen och CONC ligger i den nedre panelen), hippocampus (B, B', HSDH gruppen ligger i den övre panelen och CONH ligger i den nedre panelen), och striatum (C, C', HSDS-prover ligger i den övre panelen och CONS ligger i den nedre panelen) vävnader från HSD- och CON-råttor. Metaboliter på värmekartan är organiserade genom hierarkisk klustring baserat på den övergripande likheten i nivåmönster. Venn-diagram (D) som illustrerar metabolitöverlappning mellan HSDC-CONC, HSDH-CONH och HSDS-CONS jämförelser.

Metabolitkorrelationsanalys

Förhållandet mellan eller bland metaboliter var så komplext i fig 5A'-5C'. För energimetaboliterna, de positiva korrelationerna för Lac vs Ala i HSDC, AMP vs IMP i HSDH, ATP vs Pcho i HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA i HSDS, och de negativa korrelationerna för Lac vs Thr och GSH vs. Suc i HSDH, Suc vs Val i HSDS var närvarande i metabolitkorrelationsplotterna. För neurotransmittorerna fanns de positiva korrelationerna för GABA vs Car i HSDC, GABA vs Cho i CONH och GABA vs Suc/Ino/Gln i HSDS i metabolitkorrelationsplotterna. De negativa korrelationerna för GABA vs FMA i CONC och GABA vs NAA/Ura/NADP plus i CONS fanns i metabolitkorrelationsdiagrammen. För metaboliter relaterade tilloxidativ stress, denpositiva sambandför GSH vs Asn i HSDC och CONC, Tau vs Lac i HSDH, Tau vs Suc/Ala i CONH, var de negativa korrelationerna för GSH vs Suc i HSDH, Tau vs Thr i HSDH närvarande i metabolitkorrelationen tomter.

Metabolomisk väganalys

Kvantitativ väganalys bestående av väganrikningsanalys och vägpåverkan från vägtopologi avslöjade högst statistiskt signifikanta HSD-inducerade moduleringar till en serie metabola vägar. Pathway impact-poäng, tillsammans med falsk upptäcktsfrekvens (FDR) och p-värden, beskrivs i Fig. 6. Banor ansågs vara signifikant berikade om p-värden var lägre än 0.05; de profilerade metaboliterna (träffarna) i förhållande till de totala metaboliterna av vägen (matchstatus) var högre än 1; och effektpoängen (som indikerar effekten av signifikant påverkade metaboliter i vägen baserat på nätverkstopologimått på relativ centralitet mellan varandra) var högre än 0. Banorna i cortex (Fig 6A) med det största metaboliska påverkansvärdet varfenylalanin, tyrosin, ochtryptofanbiosyntes>fenylalaninmetabolism> pyrimidinmetabolism > alanin-, aspartat- och glutamatmetabolism. Vägarna i hippocampus (Fig 6B) med störst metabolisk påverkan var biosyntes av fenylalanin, tyrosin och tryptofan > glutationmetabolism > glycin-, serin- och treoninmetabolism > purinmetabolism > pyrimidinmetabolism > alanin-, aspartat- och gluanomatmetabolism . Vägarna i striatum (Fig 6C) med störst metabolisk påverkan var alanin-, aspartat- och glutamatmetabolism > nikotinat- och nikotinamidmetabolism > purinmetabolism.

Fråga för mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950