Oxidativ stress, dysfunktionell energimetabolism och destabiliserande neurotransmittorer förändrade den cerebrala metaboliska profilen i en råttmodell av simulerad heliox-mättnadsdykning till 4,0 MPa

Abstrakt

Huvudsyftet med denna studie var att fastställa metaboliska profilförändringar i hjärnan hos råttor efter simulerad heliox-mättad dykning (HSD) till 400 meter havsvatten jämfört med blankkontrollerna. Förändringar i den polära metabolomen i råtthjärnan på grund av HSD undersöktes ibark, Hippocampus, ochstriatumvävnadprover genom att tillämpa ett NMR-baserat metabolomiskt tillvägagångssätt kombinerat med biokemisk detektion i cortex. Deminskning av glutation- och taurinnivåernakan hypotetisktöka antioxidantförsvaretunder mättnadsdykning, vilket också bevisades avökad malondialdehydnivå, denminskat superoxiddismutas, och denminskat glutationperoxidasi cortex. Den samtidiga minskningen av aeroba och anaeroba metaboliska vägar omfattade nedreglerad energimetabolism, vilket också bevisades genom den biokemiska kvantifieringen av de metabola enzymerna Na-K ATPase och LDH i hjärnbarkens vävnad. Designifikanta metaboliska abnormiteter hos aminosyraneurotransmittorer, såsom GABA, glycin och aspartat, minskade aromatiska aminosyror, inklusivetyrosinoch fenylalanin, som båda är involverade imetabolism av dopaminoch noradrenalin, som nedregleras i cortex. Noterbart är en minskning av N-acetylaspartat associerad med neuronal skada. Sammanfattningsvis påverkade hyperbar dekompression av en 400 msw HSDhjärnans metabolomi en råttmodell, potentiellt innefattande ett brett spektrum av störande aminosyrahomeostas, metaboliter relaterade till oxidativ stress och energimetabolism, och destabiliserande neurotransmittorkomponenter. Dessastörningarkan bidra tillneurokemiskaochneurologiska fenotyper av HSD.

Klicka här för att få antioxidativa Cistanche-tillskott

Introduktion

Högt tryck över 1,3 MPa (vid ungefär 120-meter havsvatten) induceras hos människor och däggdjur med risk för förändringar i centrala nervsystemet (CNS) [1, 2]. CNS kan vara ett av de mest känsliga målen vid för högt atmosfäriskt tryck, gasbubblor i kroppen och tryckfallssjuka (DCS) orsakad av djuphavsdykning. Under sådana tillstånd är en serie psykomotoriska och kognitiva manifestationer mycket komplexa, med distala och proximala skakningar, elektroencefalografiska avvikelser, fascikulationer, myoklonus, sömnstörningar, illamående, huvudvärk, yrsel och nedsatt prestationsförmåga vid kognitiva tester [2–4]. Moen et al. uppmätta regionala neurologiska abnormiteter genom diffusions- och perfusionsviktad magnetisk resonanstomografi (MRT). Perfusionsbrist i cerebral mikrovaskulär funktion med arteriella mikroemboli [5] hittades hos dykare i Nordsjön, bevisat genom minskad medelövergångstid på grund av minskad komplexitet i det mikrovaskulära eller kapillära systemet. Alvhild Alette Bjørkum et al. fann störande proteinhomeostas, t.ex. i synaptiska vesiklar, och destabiliserande cytoskelettkomponenter efter heliox-mättnadsdykning i en råttmodell. Arvid Hope et al. rapporterade att inga synliga CNS-skador av morfologiska förändringar under MRI-skanning observerades hos råttor med massiva neurologiska symtom på tryckfallssjuka efter heliox-mättnadsdekompression [6]. Således antar vi att potentiella molekylära profilförändringar bakom sådana betydande men tvetydiga fysiologiska abnormiteter kan observeras i CNS-vävnaden efter en heliox-mättnadsdykning.

Identifieringen av biomarkörer för att övervaka statusen för cellulära fysiologiska mekanismer är viktig för att förstå biokemiska händelser. Det är alltid en utmaning med tanke på komplexiteten och mångfalden av molekylära vägar som är involverade i biologiska systems respons på olika faktorer i ett specifikt ögonblick eller tillstånd. Tidigare försök att koppla samman enskilda biomarkörer med funktionell CNS-störning har gett viss insikt om oxidativ skada och energimetabolism efter mättnadsdykning [3, 4, 7]. På liknande sätt har flera studier jämfört profilerna för aminosyran av neurotransmittorer hos råttor med högtrycksneurologiskt syndrom med de hos friska individer [2]. Att illustrera det neurologiska metaboliska fingeravtrycket av CNS-fritid kan gynna etiologiska hypoteser [8, 9], förebyggande [10] och terapeutiska metoder [11]. Den integrerade neurologiska metaboliska störningen inducerad av ett stort djup av heliox-mättnadsdykning har dock inte undersökts. Sådan information från komplexa biologiska system kan snabbt registreras på grund av framsteg inom tekniska metoder [12]. Tillämpningen av högupplöst kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi kan ge extrema mängder av hög komplexitet men tolkbara och robusta metaboliska profileringsdata. Spektraldata för biovätskor och vävnadsmetabolitextrakt kan erhållas med hjälp av kemometriska och bioinformatiska metoder för att avslöja fysiologisk eller patologisk statusinformation. NMR-spektroskopi ger omedelbar kvalitativ och kvantitativ information om cirka 102 olika små molekyler som finns i ett biologiskt prov. NMR-detektion möjliggör ett brett opartiskt tillvägagångssätt utan förhandsval av specifika biokemiska vägar. Dessutom tillåter NMR analys med hög genomströmning och hög reproducerbarhet, och det är en inneboende kvantitativ teknik över ett brett dynamiskt område på grund av det linjära svaret av NMR-signaler inom en koncentration. Denna teknik har framgångsrikt tillämpats på neurologiska sjukdomar som cerebellär ataxi [13], Huntingtons sjukdom [14, 15] och Alzheimers sjukdom [16, 17] i både prekliniska och kliniska studier

Trots den lovande tillämpbarheten av NMR-baserad metabolomik har dess tillämpning för att utvärdera de centrala nervösa metaboliska störningseffekterna av heliox-mättnadsdykning inte rapporterats. Syftet med denna studie var att undersöka metabolomiska förändringar i olika anatomiska avdelningar i hjärnan (cortex, hippocampus och striatum) och biokemiska indexnivåförändringar i cortex i en råttmodell efter simulerad 400 meters heliox-mättnadsdykning i havsvatten (MSW) , vilket visas av den schematiska experimentella designen av den aktuella forskningen i Fig. 1. Illustrationen av målorganets metaboliska fingeravtryck kan ge en uppsättning tillgängliga biomarkörer som kan bidra till förbättringar av dykprocedurer.

Fig 1. Schematisk experimentell design av den aktuella forskningen

Experimentella procedurer

Vi bekräftar att vi har läst tidskriftens ståndpunkt i frågor som rör etisk publicering och bekräftar att denna rapport är förenlig med dessa riktlinjer.

Reagens och material Natriumklorid av analytisk kvalitet, DMSO, NaN3, NaH2PO4•2H2O och Na2HPO4•12H2O köptes från Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Kina). HPLC-kvalitet CHCI3 och CH3OH erhölls från Merck (Darmstadt, Tyskland). D2O (99,9 procent i D) innehållande natrium 3-(trimetyl-silyl) propionat-2, 2, 3, 3, d4 (TSP) som en intern standard för referens för kemiska skift tillhandahölls av Sigma–Aldrich (MO, USA). Ett buffertsystem innehållande 0,2 M Na2HPO4/NaH2PO4 i D2O vid pH 7,4 bereddes för att förhindra pH-effekten på de kemiska förändringarna av metaboliter vid olika koncentrationer. Analyssatserna för bestämning av natrium-kalium-ATPas (Na-K-ATPas), kolinesteras (AChE) och laktatdehydrogenas (LDH) köptes från Abcam (USA). Analyssatserna för dopamin (DA) köptes från RD, USA, analyssatserna för epinefrin (E) och noradrenalin (NE) var från Abnova, Taiwan, 5-hydroxitryptamin (5HT) analyssatser var från BioSource, och gamma-aminosmörsyra (GABA) analyskit var från Santa Cruz, USA. Analyssatserna av superoxiddismutas (SOD), malondialdehyd (MDA) och glutationperoxidas (GPx) köptes från Cayman, USA.

Etikgodkännande

Alla experimentella protokoll godkändes av Animal Ethics Committee of Naval Medical Center i PLA, Naval Medical University (godkännandenr: SYXK(Shanghai)2017-0019, godkännandeår: 2020). Alla djur fick god vård enligt Guide of the Care and Use of Laboratory Animals of Naval Medical University. Vi bekräftar att alla metoder rapporteras i enlighet med ARRIVE-riktlinjer (https://arriveguidelines.org) för rapportering av djurförsök. Deltagarna som undersöktes i denna studie var råttor, inte människor; det fanns alltså inget samtycke att delta.

Djur och grupperingsdesign

Vuxna Sprague–Dawley-hanråttor med en medelålder på 8 veckor och som vägde 200–220 g inkluderades i denna forskning. Djur köptes från Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Maximala ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och det antal djur som krävs för att fånga tillförlitliga data. Standardråttfoder och dricksvatten var tillgängligt för alla djur ad libitum. Djur med 3 råttor per bur hölls i ett specifikt patogenfritt (SPF) djurrum (temperatur, 22–24˚C, luftfuktighet, 45–55 procent) och kontrollerade ljusförhållanden (12/12 timmars ljus-mörkercykel) i en vecka före experimentet. Innan dykexperimenten inleddes acklimatiserades råttor i fem dagar i labbmiljön, inklusive en hyperbarisk kammare. Sexton råttor vägdes, märktes, begränsades slumpmässigt tilldelade till en kontrollgrupp (exponering för normobarisk luft men med liknande ljus och buller, benämnd CON-gruppen, n=8) och en experimentell (utsatt för en simulerad heliox-mättnadsdykning för att 4,0 MPa (400 msw), benämnd HSD-gruppen, n=8).

Stimulerad mättnadsdykning på 400 msw

Råttor i HSD-gruppen trycksattes i helium-syregas i en hyperbarisk kammare. I korthet ingick fyra faser av kompression, lagring, dekompression och böjövervakning

mättnadsperioden. Råttans kompressionshastighet var 1 msw/min upp till 10 msw med 20 procent He O-gasblandningar och 3,54 msw/min från 10 msw/min med ren He. Tidskomprimeringen från ytan till 400 msw tog ungefär 120 minuter. Bottenfasen vid 400 msw var 120 minuter. Syrekoncentrationen kompletterades med rent syre för att bibehålla syrepartialtrycket vid 35~50 kPa under kompressionsprocessen och lagringsdjupet. Perioden för dekompressionsböjning var 40 min vid 300 msw, 45 min vid 200 msw, 50 min vid 105 msw, 60 min vid 45 msw, 75 min vid 10 msw, 75 min vid 3 msw, och sedan vid ytan. Uppstigningshastigheten som används i denna dekompressionsmodell är cirka 10 meter (33 fot) per min. syrepartialtrycket hölls vid 38~67 kPa under dekompressionssteget. Efter dekompression till 10 m hölls syrekoncentrationen vid 20~24 procent. Översikten över mättnadsdykningens tidslinje visas i Fig. 2. Råttor i luftkontrollgruppen (Grupp CON, benämnd kontrollgruppen, med åtta råttor) föddes upp i den atmosfäriska miljön i samma experimentlabb med samma kammare som HSD-grupperna. Kontrollgruppen fick inga komprimerings- eller dekomprimeringsprocedurer utan utstod liknande ljud och ljus som HSD-gruppen.

Provsamling

Efter dekompressionsperioden bedövades råttorna med pentobarbitalnatrium ({{0}},3 procent, 1,0 ml/kg råttvikt) intraperitonealt, följt av avlägsnande av hjärnan. De vänstra hjärnhemisfärerna dissekerades snabbt. I två djurgrupper dissekerades cortex-, hippocampus- och striatumvävnaderna och förkortades respektive HSDC, HSDH, HSDS, CONC, CONH och CONS. Som den största vävnaden bland de tre avdelningarna skars sedan varje cortexprov i två delar med ungefär lika vikt (en del av provet för metabolomisk analys, de andra provbitarna för biokemiska bedömningar). Alla vävnader snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -80˚C tills vidare analys.

Fråga för mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950