Del 1: Etablering av den samtidiga experimentella modellen för osteoporos i kombination med Alzheimers sjukdom hos råtta och de dubbla effekterna av Echinacoside och Acteosid från Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRAKT
Etnofarmakologisk relevans: Cistanche tubulosaär en dyrbar traditionell kinesisk medicin som har använts i stor utsträckning vid behandling av osteoporos ochAlzheimers sjukdom. Echinacosideoch akteosid är de huvudsakliga aktiva beståndsdelarna i Cistanche tubulosa som har farmakologiska aktiviteter med forskningsvärde. Det har rapporterats att echinacoside ochakteosidskulle kunna förbättra inlärnings- och minnesförmågan, främja proliferation och differentiering av osteoblast. Syfte med studien: Echinakosid och akteosid frånCistanche tubulosahar visat betydande aktiviteter mot osteoporos och anti-Alzheimers sjukdom, medan dessa effekter inte har studerats samtidigt i en råttmodell. Syftet med denna studie var att etablera och verifiera modellen för osteoporos i kombination medAlzheimers sjukdomhos råttor och för att undersöka de dubbla effekterna avechinakosidoch acteosid på denna samtidiga modell.
Material och metoder:Tre modellgrupper av ovariektomi (OVX), skenkirurgi med D-galaktos och AlCl3 (D), ovariektomi med D-galaktos och AlCl3 (OVX plus D) sattes samtidigt. Råttorna i läkemedelsbehandlingsgrupper ovariektomerades. Under den intraperitoneala injektionen av D-galaktos och intragastrisk administrering av AlCl3 i råttorna i läkemedelsbehandlingsgrupper administrerades råttorna oraltechinakosid(90 mg/kg/d),akteosid(90 mg/kg/d), respektive de positiva kontrollläkemedlen östradiolvalerat (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d). Efter läkemedelsbehandlingen på 8 veckor utfördes först Morris Water Maze (MWM) test under 6 dagar. Råttorna offrades sedan för att skörda blod, livmoder, lårben, skenben och hjärnvävnader. Serumet användes för biokemiska tester. Livmodern användes för histomorfometri. Den högra lårbenet användes för mikro-CToch histomorfometri, respektive. De högra tibiae användes för det biomekaniska testet. Hippocampus som samlades på islådan användes för biokemiska tester. Hjärnan 41 uppsamlad genom perfusion användes för histomorfometri.
Resultat:Jämfört med Sham-gruppen kunde OVX plus D-gruppen signifikant minska inlärnings- och minnesförmågan genom att orsaka oxidativ skada, försämra neuroner i hippocampus och påverka hydrolysen och syntesen av acetylkolin. Samtidigt ökade aktiviteterna för BALP och TRAP i OVX plus D-gruppen avsevärt (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinakosidochakteosid, de typiska patologiska dragen av osteoporos ochAlzheimers sjukdomförbättrades.
Slutsatser:Modellen av osteoporos i kombination medAlzheimers sjukdomi råttor var genomförbart och framgångsrikt etablerat.Echinacosideoch acteosid visade också några betydande effekter på denna samtidiga modell, och de kan vara potentiella 56 kandidater frånCistanche tubulosamed dubbla effekter för vidare studier.
Nyckelord:osteoporos; Alzheimers sjukdom; dubbla effekter; echinakosid; akteosid; Cistanche tubulosa
Cistanche lost empire örter lindrar Alzheimers sjukdom
1. Introduktion
Osteoporos är en degenerativ bensjukdom som kännetecknas av en progressiv förlust av benmassa och förstörelse av mikroarkitektur, vilket kan öka risken för skörhetsfraktur (Rachner et al., 2011).Alzheimers sjukdom(AD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom hos äldre som kännetecknas av kontinuerlig mental försämring, kognitiv försämring och förlust av självständig livsförmåga i kliniska studier (Reitz 76 et al., 2011). Bildandet av senil plack-inducerad av -amyloidavsättning, neurofibrillära trassel orsakade av tau-hyperfosforylering och neuronal degeneration i hjärnan är de typiska patologiska egenskaperna hos AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Ytligt sett är OP och AD helt oberoende sjukdomar med olika patologi och kliniska egenskaper. OP och AD observeras dock ofta förekomma samtidigt i klinisk praxis (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Prevalensen av båda sjukdomarna ökade med åldern, särskilt hos postmenopausala kvinnor (Li et al., 2017; Stern, 2012). Fler och fler bevis tydde på att personer med diagnosen AD har en ökad risk för OP (Zhou et al., 2014).
Det är nödvändigt att studera och klargöra sambanden mellan osteoporos ochAlzheimers sjukdomin vitro och in vivo. Innan studierna utförs in vivo är det viktigt att välja tillämpliga djurmodeller för osteoporos eller Alzheimers sjukdom. Osteoporosmodellen kunde etableras genom flera typer av metoder såsom intragastrisk administrering av retinsyra, ovariektomioperation och intramuskulär injektion av glukokortikoider (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Speciellt var den postmenopausala osteoporosmodellen inducerad av ovariektomi hos råttor klassisk ochhar använts flitigt i de flesta av studierna (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Sporadisk Alzheimers sjukdom är den huvudsakliga typen av Alzheimers sjukdom. Djuretmodeller av sporadiskaAlzheimers sjukdomkan induceras med olika metoder som t.exinjektion av D-galaktos eller -amyloid, intragastrisk administrering av AlCl3,och så vidare(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Dessutom harkonjunktionsmodell av Alzheimers sjukdom inducerad av långvarig intraperitonealinjektion av D-galaktos i kombination med ovariektomi har också studerats mycket (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). För att avslöja relevansen av osteoporos ochAlzheimers sjukdom, är det nödvändigt att fastställa modellen för osteoporos kombineratmed Alzheimers sjukdom att studera de vanliga mekanismerna för läkemedel påosteoporos ochAlzheimers sjukdomase.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight är en parasitisk växt, som huvudsakligen finns i öknarna i nordvästra Kina. De torkade saftiga stjälkarna avCistanche tubulosa(CT) används som ett känt toniskt läkemedel som heter Cistanches Herba med dess kinesiska namn Roucongrong i den kinesiska farmakopén (2015). Den har hedrats som "öknarnas ginseng" och används i stor utsträckning för behandlingar av midje- och knäsmärtor, kvinnlig sterilitet och förstoppning inom traditionell kinesisk medicin (Jiang och Tu, 2009). De huvudsakliga aktiva beståndsdelarna i CT är fenyletanoidglykosider (PhGs), echinacoside (ECH) ochakteosid(ACT) är de representativa föreningarna i PhG (Morikawa et al., 2014). Särskilt ECH och ACT väljs vanligtvis ut som markörer för kvalitetskontroll i CT på grund av deras höga innehåll och olika farmakologiska aktiviteter såsom effekterna av neuroprotection, benskydd,
antioxidanter, anti-aging och förbättrad inlärnings- och minnesförmåga (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Men effekterna av ECH och ACT på osteoporoskombinerad medAlzheimers sjukdomhade ännu inte studerats tillsammans i en råttmodell.Sålunda var syftet med denna studie att etablera en råttmodell av osteoporos kombineradmed Alzheimers sjukdom och utforska effekterna avechinakosidoch acteoside på dettasamtidig modell, för att ge experimentella bevis för ytterligare studier avmolekylär mekanism för echinakosid eller akteosid i följande forskning.
cistanche pharma specialförAD
2. Material och metoder
2.1. Djur
Åttio 8-veckor gamla Wistar-honråttor (certifikatnummer: SCXK 2018-0006), som vägde 180~200 g, förvärvades från Sino-brittiska SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, Kina) och uppvuxen i Experimental Center of Pharmaceutical Animals i China Pharmaceutical University.
2.2. Kemikalier och reagens
Klorhydrat, penicillin G-natrium, D-galaktos, aluminiumkloridhexahydrat, östradiolvalerat, donepezil HCl köptes från Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Kina).Echinacoside(HPLC 94 procent) erhölls från Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina).Akteosid(HPLC 98 procent) köptes från Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). Benspecifikt alkaliskt fosfatas (BALP), tartratresistent surt fosfatas (TRAP), superoxiddismutas (SOD), malonaldehyd (MDA), acetylkolinesteras (AChE) och kolinacetyltransferas (ChAT) enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) köpt från Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Universal vävnadsfixativ erhölls frånChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina).
echinakosid
2.3. Djurmodeller och behandlingar
Alla djurförsök godkändes och övervakades av Animal Ethics Committee of China Pharmaceutical University. Råttorna hölls med en 12 timmars ljus/mörkercykel i ett temperaturkontrollerat rum (22±2 grader) och matades med standardpelleterat foder och kranvatten.
Efter en veckas anpassning uppnåddes osteoporosmodellen genom att utföra ovariektomioperation (French et al., 2008). Efter att operationen avslutats, stänktes natriumpenicillin G på sårsuturen en gång för att förhindra infektion. Råttorna matades sedan normalt under tre veckor. Enligt referensen (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017) är modellen avAlzheimers sjukdomkan induceras genom långvarig intraperitoneal injektion av D-galaktos i kombination med ovariektomi eller långvarig intragastrisk administrering av AlCl3. För att studera genomförbarheten av modellen för osteoporos i kombination med Alzheimers sjukdom, tre modellgrupper av ovariektomi (OVX-grupp), skenkirurgi med intraperitoneal injektion av 150 mg/kg/d D-galaktos och intragastrisk administrering av 30 mg/kg/d AlCl3 (D-grupp), ovariektomi med intraperitoneal injektion av 150 mg/kg/d D-galaktos och intragastrisk administrering av 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX plus D-grupp) sattes i denna studie.
Därför delades råttor slumpmässigt in i åtta grupper (n{{0}} för varje grupp) efter 3 veckor och behandlades oralt med läkemedel i 8 veckor: Blikgrupp; OVX-grupp; D-grupp; OVX plus D-grupp; östradiolvaleratbehandlingsgrupp (EV-grupp, OVX plus D plus 0,6 mg/kg/d östradiolvalerat); donepezil HCl-behandlingsgrupp (DPZ-grupp, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/d donepezil HCl);echinakosidbehandlingsgrupp (ECH-grupp, OVX plus D plus 90 mg/kg/d echinakosid);akteosidbehandlingsgrupp (ACT-grupp, OVX plus D plus 90 mg/kg/dag akteosid). Enligt Human-Rat Equivalent Dose Conversion Principle och dosen från relaterad referens (Li et al., 2013; Gao et al., 2014) antogs doserna för läkemedelsbehandlingsgrupper i denna studie.
Kroppsvikten för varje råtta mättes varje vecka. Efter hela behandlingen med läkemedel som varade i 8 veckor utfördes först Morris Water Maze (MWM) test i 6 dagar. Därefter avlivades 6 råttor från varje grupp för att skörda materialen. Råttorna bedövades med intraperitoneal injektion av 3,0 ml/kg 10 procent kloralhydrat, och blod samlades upp från aorta-abdominalerna. Blodet placerades vid rumstemperatur för att koagulera och centrifugerades vid 3500 r/min under 10 min. Serumet skördades i ett 1,5 ml centrifugrör (NEST Biotechnology) och lagrades vid -80 grad tills det användes för biokemiska tester. Livmodern, lårbenet, tibiae och hjärnvävnaderna samlades sedan upp. Livmodern användes för histomorfometri. Den högra lårbenet användes för Micro-CT respektive histomorfometri. De högra tibiae användes för det biomekaniska testet. Hippocampus som samlades på islådan användes för biokemiska tester. Därefter perfunderades de andra tre råttorna från varje grupp från hjärtat med saltlösning och universellt vävnadsfixativ för att skörda hjärnan för histomorfometri.
2.4. Morris Water Maze (MWM) test
Råttor utsattes för rumslig referensinlärning och minnestestning i MWM-testet efter 8 veckors intervention. MWM-testet utfördes enligt de metoder som tidigare rapporterats (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Kortfattat, 5 på varandra följande dagar med fyra försök per dag, tränades råttor att använda en mängd olika visuella signaler placerade på poolväggen för att hitta en dold nedsänkt plattform (diameter 11 cm, höjd 29 cm) i en cirkulär pool (diameter 130 cm, höjd 50 cm) fylld med giftfritt kolfärgat vatten. Poolen var tänkt uppdelad i fyra kvadranter, och fyra startpositioner var placerade i skärningspunkterna mellan kvadranter. Plattformen var belägen i mitten av en av kvadranter och positionen var konstant under försöken. I varje försök placerades råttor slumpmässigt på utvalda platser, vända mot poolens vägg. Varje försök avslutades när råttan nådde plattformen eller efter 60 s, och den förflutna tiden registrerades som flyktlatens. Råttor som misslyckades med att nå plattformen styrdes upp på den. Efter varje försök med dold plattform stannade råttan på plattformen i 10 s. Den genomsnittliga latenstiden för fyra försök per dag beräknades som träningsresultaten. På dag 6 utsattes alla råttor för en sondförsök där de simmade i 60 sekunder i poolen utan plattform. Korsningstiderna på plattformens plats och restid i målkvadranten registrerades som slutresultat. Råttor övervakades av en kamera monterad i taket direkt ovanför poolen, och alla försök registrerades och analyserades med MORRIS MAZE-programmet som tillhandahålls av Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Peking, Kina)
2.5. Biokemiskt test med ELISA
Enligt tillverkarens instruktioner för ELISA-kit testades den benspecifika alkaliska fosfatasaktiviteten (BALP), tartratresistent sur fosfatasaktivitet (TRAP), aktiviteten av superoxiddismutas (SOD) och malondialdehydhalten (MDA) i serum av BioTek Synergy 2 multi-mode mikroplattläsare (BioTek, USA). Hippocampusvävnaderna från varje grupp tvättades med PBS (0,01 M, pH 7,4) för att avlägsna blodet eller orenheter som fanns kvar på vävnadsytan. Hippocampusvävnaderna på ena sidan vägdes och skars sedan i så små bitar som möjligt. Hippocampusvävnaderna homogeniserades enligt förhållandet 1:9 (vävnadsvikt: PBS-volym). Homogenatet centrifugerades vid 4 grader, 3000 r/min under 15 min. Supernatanten uppsamlades och späddes för att mäta proteinkoncentrationen med BCA-metoden. Acetylkolinesteras (AChE) aktivitet, kolinacetyltransferas (ChAT) aktivitet, superoxiddismutas (SOD) aktivitet och malondialdehyd (MDA) innehåll i hippocampus vävnad testades sedan med ELISA metoder.
2.6. Hippocampus histomorfometri
Hjärnvävnaderna (n=3/grupp) fixerades i universellt vävnadsfixativ. Hjärnvävnadsproverna tvättades sedan, dehydrerades med gradientetanol, bäddades in med paraffinvax och skars i koronala sektioner på 5 μm. Sektionerna färgades med hematoxylin och eosin (HE). Därefter fotograferades de koronala sektionerna av hjärnvävnaden med ett inverterat fluorescensmikroskop (Nikon, Japan). De morfologiska förändringarna av CA1, CA2, CA3 och DG i hippocampus observerades särskilt.
2.7. Livmoderhistomorfometri och morfometri
De utvalda livmodern (n{{0}}/grupp) fixerades i universellt vävnadsfixativ. Livmoderns vävnadsprover tvättades sedan, dehydrerades med gradientetanol, bäddades in med paraffinvax och skars i tvärgående sektioner på 5 μm. Sektionerna färgades med hematoxylin och eosin (HE). De tvärgående sektionerna av livmodern observerades och fotograferades. Fem synfält valdes slumpmässigt ut, diametern på livmoderns tvärsnitt och tjockleken på livmoderns slemhinneepitel mättes sedan med hjälp av programvaran Image-Pro Plus 6.0. Antalet livmoderkörtlar i lamina propria räknades också.
2.8. Micro-CT
Det valda högra lårbenet (n=3/grupp) skannades i en position med avståndet från objektet till källan på 121 mm och avståndet från kameran till källan på 171 mm med hjälp av en SkyScan 1176 micro X- stråldatortomografi (mikro-CT) skanner (Bruker, Tyskland). Den distala tillväxtplattan valdes som referensyta. Med ett avstånd på 1 mm under referensytan valdes ett 1,8 mm tjockt område som den intressanta volymen (VOI, 100 lager). De resulterande gråskalebilderna hade en pixelstorlek på 17,76 μm från benrekonstruktionen (65 kV, 385 μA). En halvautomatisk kontureringsmetod användes för att välja trabeculae från kortikalt ben. Direkta 3D-mätmetoder användes för att bedöma procent av benvolym (BV/TV), benyttäthet (BS/TV), trabekulär separation (Tb. Sp), trabekulärt antal (Tb. N), trabekulär tjocklek (Tb. Th) , strukturmodellindex (SMI), trabekulär mönsterfaktor (Tb. Pd) och medelbenmineraldensitet (medel-BMD) för samma VOI med användning avCTAnalysprogram (Bruker, Tyskland). 3D-visualisering av VOI med hjälp av en adaptiv renderingsalgoritm gjordes med CTvol-mjukvaran (Bruker, Tyskland).
cistanche växtextrakt
2.9. Benhistomorfometri
Det valda högra lårbenet (n=3/grupp) fixerades i universellt vävnadsfixativ och avkalkades sedan i en lösning av 10 procent EDTA-2Na under 3 veckor. De avkalkade proverna tvättades, dehydrerades med gradientetanol, bäddades in med paraffinvax och skars i längsgående sektioner på 5 μm. Sektionerna färgades med hematoxylin och eosin (HE). De längsgående sektionerna av lårbenet fotograferades. Benvävnadsstrukturerna i varje grupp, speciellt de trabekulära benstrukturerna, observerades.
2.10. Biomekaniskt test
De högra tibiae (n=4/grupp) som valdes slumpmässigt utvärderades för trepunktsböjningstestet med en universell testmaskin (SHIMADZU, Japan). Diametrarna för dessa prover mättes med nockmått i intervallet 2.16-2.38 mm (d). Provet placerades sedan på två stödjande tvärstänger med ett avstånd på 25 mm (L) mellan de två skenorna och provets fysiologiska krökning var uppåt. Laddningsstången för lasten var placerad i mitten av provet och föll med en konstant hastighet av 1,5 mm/min tills provet bröts. Kraften (F) och förskjutningsdata registrerades automatiskt i en dator som var kopplad till testmaskinen och last-deformationskurvan plottades samtidigt. Värdena för maximal belastning (N) och energiabsorption (mJ) registrerades av materialtestprogramvaran TRAPEZIUM X samtidigt. Värdena för maximal spänning (MPa) beräknades enligt följande formel: Spänning (σ)=böjmoment (M) / Sektionsfaktor (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. Statistisk analys
Resultaten från modellgrupperna jämfördes med Sham-gruppen och resultaten från de läkemedelsbehandlade grupperna jämfördes med OVX plus D-gruppen. Data analyserades med envägs ANOVA följt av Bonferronis multipla jämförelsetest med Graph Pad Prism 5.0 programvara. Data uttrycktes som medelvärde ± SD, och P-värden på mindre än 0.05 ansågs vara statistiskt signifikanta.
myricetinochcistanche
