Del 2: Kalpastatin förhindrar angiotensin Il-medierad podocytskada genom underhåll av autofagi

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Snälla klicka här till del 1

Snälla klicka här till del 3

Angel plus HSD aktiverar calpainaktivitet i podocyter som bidrar till autofagiblockad

Eftersom calpain-aktivitet befanns (i) aktiveras av Angel i flera celltyper och (ii) för att klyva flera autofagirelaterade proteiner, undrade vi om AngII plus HSD-medierad autofagiblockad kunde tillskrivas ökad Angl-inducerad calpainaktivitet. Vi fann först att primära podocyter uttryckte de 3 allestädes närvarande formerna av calpains (Figur 3a). Vi visade sedan att AngII stimulerade kalpainaktivitet i primära podocyter. Denna ökning av kalpainaktivitet blockerades av en selektiv kalpainhämmare (Figur 3b). Vi använde en knock-in-mus med ytterligare calpastatin-transgenuttryck (som leder till minskad calpain-aktivitet) för att bedöma rollen av calpains i AngII plus HSD-medieradnjureskadaoch autofagi blockad. Primära podocyter från CST'g-möss visade minskad kalpainaktivitet som svar på AngII jämfört med podocyter från kontrollmöss (Figur 3c). Sålunda minskade överuttryck av kalpastatin i podocyter AngII-medierad kalpainaktivering.

Cistanchetubulosahar mångaeffekter, klicka här för att veta mer

Vi bedömde sedan autofaginivåer i podocyter från CSTTg-möss. Vi genererade CST-möss med GFP-LC3-transgenen. LC3-GFP-reportern tillät räkning av autofagosomer som GFP plus /P62 plus punkter. P62 kommer att ackumuleras i aggregat i celler när det autofagiska flödet blockeras. Vid basaltillståndet räknade vi färre GFP plus P62 plus prickar (Figur 4a, b och e) och mindre P62-ackumulering (Figur 4c, d och f) i podocyter från CST1g GFP-LC3-möss än i normala podocyter

Figur 4|Utvärdering av autofagiskt flöde i podocyter från calpastatin transgena (CST9) möss. (a,b) Representativa immunofluorescensbilder av uttrycket av grönt fluorescerande protein (GFP) (grönt) och P62 (röd) i glomeruli från 12-veckogamla GFP-LC3- och CST'GFP-LC3-möss. Pilspetsarna indikerar GFP plus P62 plus autofagosomer. (c,d) Representativa immunfluorescensbilder av uttrycket av P62 (grönt) och Podocalyxin (PODXL; rött) i glomeruli från 12-veckogamla GFP-LC3- och CST'9 GFP-LC3-möss. Figurunderdelar med primtal indikerar högre förstoring. Kärnor färgades med Hoechst （blå）. Barer=50 μm. （e） Kvantifiering av antalet LC3 plus P62 plus prickar per podocyt. Mann-Whitney test:**P=0.0065. (f) Kvantifiering av P62 plus area per glomerulär sektion. Mann-Whitney test:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 GFP-LC3 möss och n =8 CST'9 GFP-LC3 möss. Värden presenteras som individuella diagram och medel ± SEM. För att optimera visningen av denna bild, se onlineversionen av den här artikeln på GFP-LC3-möss, vilket tyder på ökat autofagiskt flöde i podocyter från möss med högt kalpastatinöverflöd.

Autofagiskt flöde kan övervakas genom mätning av omvandlingen av den cytoplasmatiska formen av LC3, LC3-I, till den autofagosomalklyvda och fosfatidyletanolaminkopplade formen av LC3, LC3-II, på Western blot . Podocyter från CST-möss visade ökad LC3-I till LC3-II-omvandling och minskat P62-uttryck, både i närvaro och i frånvaro av bafilomycin A, (Figur 5a och b), vilket tyder på ökat autofagiskt flöde i podocyter med calpastatin överuttryck. Slutligen var ackumuleringen av GFP plus P62 plus prickar i podocyter efter klorokinadministrering viktigare i CST'g GFP-LC3 möss än i GFP-LC3 möss, vilket bekräftar att kalpastatin överuttryck inducerar autofagiskt flöde i podocyter in vivo (Figur 5c) -e). Sammantaget tyder våra data på att AngII stimulerar calpainaktivitet i podocyter, att autofagi hämmas av calpain i podocyter och att hämning av den endogena calpainaktiviteten genom calpastatinöveruttryck är tillräcklig för att stimulera autofagiskt flöde i podocyter.

CSTT9-möss är skyddade från Angel plus HSD-inducerad podocytskada

CSTT: möss visade inganjureförändring till minst 12 månaders ålder (tilläggsbild S5). Vi analyserade podocytskada i CST'号-möss under AngII plus HSD-behandling. Även om WT-möss utvecklade mild glomeruloskleros och podocytskada efter 4 veckors hypertoni, vilket framgår av onormalt uttryck av podocalyxin och nefrin, uppvisade CSTTg-möss färre sklerotiska glomerulära lesioner (Figur 6a)

Figur 5|Blockering av autofagosomal nedbrytning bekräftade ökat autofagiskt flöde av podocyter i calpastatin transgena (CSTT) möss. (a) Western blot-analys av uttrycket av LC3. Sequestosome 1(SOSTM1)/P62 och ATG5 i primära podocyter från vildtyp (W eller CST'9-möss. Tubulinuttryck fungerar som normalisering. Podocyter behandlades eller inte behandlades med bafilomycin A1(BafA1; 100 nM) i 4 timmar före odling arrestering. (b) Kvantifiering av förhållandena LC3-ll/'tubulin och P62/tubulin.n=10 WT-möss och n =8 CST'9-möss. Värden presenteras som individuella diagram och medelvärde ± SEM. Tvåvägsvariansanalys parad för behandling: för LC3-ll/tubulin: genotyp, P= 0.0008;behandling, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">njure-international.org.

Figur 6| Överuttryck av kalpastatin förhindrar angiotensin Il (Angel) plus högsaltdiet (HSD)-medierad podocytskada. (a,b)

Cistanchekan lindranjursjukdom

Representativa bilder av Massons trikromfärgade sektioner av glomeruli från vildtyp (WT och calpastatin transgena(CST'9) möss efter 6 veckors Angll plus HSD.Bars=50 um.(c,d,f,g) Representativa immunfluorescensbilder av uttrycket av (c,d) Podocalyxin (PODXL) och (f,g)nefrin (NPHS1) i WT- och CST'9-möss efter 6 veckors Angel plus HSD och (e,h) associerade kvantifieringar. {8}} um. (ii)

cistanchekan behandlaakut njursvikt

Representativa immunofluorescensbilder av uttrycket av Wilms tumör 1 (WT1; grön) och PODXL (röd) i glomeruli från WT- och CST-möss efter 6 veckors Angel plus HSD och (k) associerad kvantifiering av antalet WT1 plus-celler per glomerulär sektion. Kärnor färgades med Hoechst(blå). Barer =50 um. I (e,h,k) presenteras värden som individuella diagram och medelvärde ± SEM,n =9 WT-möss och n=7 CSTTg-möss. Oparat t-test med lika SD:**P =0.0095 in (e),*P=0.0249 in (h), P=0.7891 in (k).

och b) och konserverad podocalyxin- och nefrinexpression (Figur 6c-h). Sådana skillnader i podocytfenotyp observerades vid ett stadium där tätheten av podocytkärnor inte var annorlunda mellan WT och hypertensiva CST'g-möss (Figur 6i-k).

På liknande sätt, efter 6 veckors hypertoni, visade GFP-LC3- och CST'1 GFP-LC3-möss podocytskada men lesioner var mer framträdande i GFP-LC3-möss (Figur 7). Urinalbumin-till-kreatinin-förhållandet var högre i GFP-LC3-möss efter 4 veckors AnglI plus HSD (Figur 7a). Podocytantalet skilde sig inte mellan de två genotyperna, men nefrinuttrycket var signifikant mer minskat i GFP-LC3 (kontroll) möss (Figur 7b-e). I samband med kalpastatinmedierat skydd visade den ultrastrukturella analysen mild och fokal podocytfotprocessutslagning i GFP-LC3-möss behandlade med Angl plus HSD med bättre bevarande av fotprocessutskärningen i CST'g-möss, även om den globala kvantifieringen av antalet fotprocesser per glomerulär basalmembran (GBM) längd var inte statistiskt annorlunda, troligen eftersom podocytskada är fokal och segmentell i vår modell (Figur 7f-h). Att notera, makrofager och T-lymfocytinfiltration injurarvar inte olika mellan grupperna (kompletterande figur S6). Sammantaget visade dessa resultat att kalpastatin förhindrade AngII plus HSD-inducerad podocytskada.

Kalpastatin-överuttryck återställer autofagiskt flöde i podocyter från möss efter Angel plus HSD-behandling

Slutligen undrade vi om kalpastatin-medierat glomerulärt skydd i AngII plus HSD-modellen implicerade autofagi underhåll i podocyter. Intressant nog förhindrades AnglI plus HSD-inducerad P62-ackumulering i podocyter i CSTTg- och GFP-LC3 CST'g-möss (Figur 8a-d), vilket indikerar att kalpastatin förhindrade blockad av podocytautofagi. Notera att antalet GFP plus P62 plus prickar märkning av auto-fagosomer var liknande i podocyter från hypertensiva GFP-LC3 och GFP-LC3 CST möss, vilket tyder på att AnglI plus HSD inducerade en avmattning av podocyt autofagisk flöde snarare än ett fullständigt stopp (Figur 8e-g).

In silico-förutsägelse av calpain-klyvningsstället i podocytproteiner

Vi använde flera in silico-verktyg för att förutsäga potentiella calpain-mål i podocyter (kompletterande tabeller S1 och S2). Tre onlinedatabaser jämfördes: GPS-CCD,4CaMPDB,5 och DeepCalpain. grad In silico-analys identifierade flera podocytproteiner, nefrin och podocin bland dem, som kunde klyvas av calpains. Kalpastatinmedierat glomerulärt skydd kan således kopplas till en minskning av kalpains enzymatiska aktivitet, vilket leder till minskad nedbrytning av vissa podocytproteiner.

Dessutom är minst 3 autofagi-relaterade proteiner direkta mål för calpains. ATG5 klyvs av kalpainer, vilket leder till en störning i ATG12-ATG5-komplexbildningen.57 Administrering av kalpainhämmare in vivo förhindrade också klyvning av autofagiproteinet Beclin-1.5"In silicoanalys av förmodat klyvningsställe på autofagirelaterade proteiner stöder hypotesen att calpain skulle kunna reglera autofagi genom den enzymatiska klyvningen av autofagiproteiner.

mRNA-uttryck av endoplasmatiskt retikulum (ER) och oxidativ stressmarkörer i glomeruli från möss behandlade med Angll plus HSD

Vi utvärderade endoplasmatisk retikulum (ER) stress och oxidativ stress genom kvantitativ PCR i glomeruli under AngII plus HSD behandling (tabell 1). Vid baslinjen observerade vi ingen förändring i mRNA-uttryck av analyserade gener i glomeruli5loxlox-möss (kompletterande från WT och Nphs2.cre Atg5 Figur S7). Efter 6 veckors högt blodtryck, glomeruli från Nphs2. cre Atg5loxlox-möss visade olika mRNA-profiler av gener från ER-stress- och oxidativ stressvägar med ökat uttryck av Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl och Hsp90b1 jämfört med WT glomeruli, vilket tyder på att autofagi-utarmning i podocyter gynnade AngII plus HSD-inducerad ER-stress och oxidativ stress. Omvänt visade glomeruli från CST-möss nedreglering av flera gener av ER-stress- och oxidativ stressvägar samt minskat uttryck av vissa pro-apoptotiska gener (Figur 9).

Sammantaget indikerar dessa resultat att överuttryck av kalpastatin kan förhindra glomerulär skada genom att minska AngII plus HSD-inducerad ER och oxidativ stress.

DISKUSSION

I den aktuella studien visade vi att i AngII plus HSD-inducerad hypertoni är podocytautofagi markant nedreglerad. Dessutom var möss med podocytspecifik deletion av Atg5 mer benägna att AngI plus HSD-inducerad glomeruloskleros och podocytförlust, vilket visar att autofagi i podocyter förhindrar utvecklingen av hypertensiv nefropati, vilket belyser den kritiska rollen av autofagi i Angl plus HSD-inducerad podocyter skada. Lite är känt om de extracellulära stimuli som reglerar cellulär autofagi, och dessa resultat kastar ljus över den patofysiologiska regleringen av podocytautofagi av AngII.

I de flesta mänskliga glomerulopatier är utplåning av podocytfotprocessen ett kännetecken för glomerulär skada som leder till proteinuri. Autofagi kommer sannolikt att spela en viktig roll för att upprätthålla podocytfunktionen eftersom dessa terminalt differentierade celler uppvisar höga frekvenser av autofagi även i frånvaro av stress. En tidigare studie visade att Angi främjar autofagi genom generering av reaktiva syrearter i en villkorligt odödlig murin podocytcellinje.5 Produktion av reaktiva syrearter är verkligen en allmän inducerare av autofagi i många celltyper och orsakerna till en sådan diskrepans med vår fynden är oklara. Till skillnad från denna senare studie använde vi murina primärodlade podocyter som bibehöll podocin- och nefrinuttryck och in vivo-metoder och inte murina cellinjer. Vi bekräftar tidigare rapporter om att postmitotiska podocyter uppvisar en ovanligt hög nivå av konstitutiv autofagi. Mätning av den ökade mängden LC3-II efter AngII-stimulering i närvaro eller frånvaro av lysosomala inhibitorer är nödvändig för att fastställa

om autofagiskt flöde är ökat eller blockerat. Tidigare studier har försummat detta fenomen.

Här använde vi en hypertensiv modell baserad på AnglI perfusion och HSD. Podocyter uppvisar ATI-receptorer och exponeras för fria filtrerade peptider såsom AngII1,6,26,61-6 Det antas att de observerade renoskyddande effekterna av RAAS-hämning kan bero – åtminstone delvis – på en blockad av denna podocyt -specifik RAAS. Likaså in vivo-studier

Cistanchekan lindranjursjukdom