Del 2|Glykogensyntaskinas 3b hyperaktivitet i exfolierade urinceller förutsäger utvecklingen av diabetisk njursjukdom

Klicka här för del 1

För mer information vänligen kontakta:emily.li@wecistanche.com

DISKUSSION

I USA och andra västländer är DKD fortfarande den ledande etiologin för progressivkronisk njursjukdomoch lägger en tung börda på statskassan och hälso- och sjukvårdssystemen utan att någon definitiv behandling ännu är tillgänglig.5 Det har länge varit känt att inte alla patienter med diabetes kommer att fortsätta att utveckla DN.5 Beroende på den studerade kohorten har det uppskattats att DN drabbar w30 procent till 50 procent av diabetespatienter. De åtgärder som vidtagits av nuvarande klinisk praxis för att identifiera diabetespatienter som riskerar att utveckla DKD är till stor del begränsade till ögonundersökningar för retinopati och urinanalys för albuminuri.5 Emellertid tyder konvergerande epidemiologiska bevis på att extrarenal mikrovaskulopati eller albuminuri är signifikant oförenlig med den efterföljande progressionen av DKD.12,13,26,27 Som sådan finns det ett akut behov av att utveckla en ny biomarkör för exakt stratifiering av diabetespatienter med risk för DN. Den aktuella studien rapporterar för första gången att GSK3b är överuttryckt och hyperaktivt i parenkymnjureceller i både experimentell och klinisk DN, associerade medprogression av njursjukdom. Dessutom kan GSK3b-hyperaktivitet i urinexfolierade celler sannolikt förutsäga utvecklingen av DN.

Cistanche tubulosa förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

GSK3b, ett mycket konserverat, redoxkänsligt serin/treonin-proteinkinas, är centralt involverat i insulinsignalering såväl som ett antal andra cellulära signalvägar som är avgörande för patofysiologiska processer relaterade tillnjureskada, reparation och regenerering. I insulinkänsliga vävnader, såsom levern och skelettmuskulaturen, är GSK3b aktivt under basala förhållanden och undertrycker aktiviteten av glykogensyntas.19,28 Insulin inaktiverar snabbt GSK3b via hämmande fosforylering vid serin 9, vilket resulterar i glykogenbiosyntes. En växande mängd bevis tyder på att GSK3b-dysreglering är associerad med typ 2-diabetes mellitus.19,29–31 Det finns faktiskt data som indikerar GSK3b-överuttryck och hyperaktivitet i muskler hos diabetespatienter31–33 och i fettvävnader hos feta diabetiska möss.34 Dessutom , transgent överuttryck av GSK3b i skelettmuskler hos möss orsakar försämrad glukostolerans, insulinresistens och hyperinsulinemi.29,35 Omvänt uppvisar möss som saknar GSK3b i skelettmuskler förbättrad glukostolerans.36 Konsekvent kan GSK3-hämmare, t.ex. litium, efterlikna insulinverkan i cellinjer och vävnader.37 Dessutom, hos överviktiga diabetiska möss, förbättrade GSK3-hämmare insulinkänsligheten och glukoshomeostasen.38njurehar traditionellt inte ansetts vara ett målorgan för insulinverkan. Men övertygande bevis tydde nyligen på att insulin signalerar innjureceller, i synnerhet i podocyter, spelar en nyckelroll för att upprätthålla glomerulära ochnjurehomeostas.39–41 Defekt insulinsignalering i podocyter, på grund av insulinbrist eller -resistens, är sannolikt en avgörande initiator för många av de patologiska lesioner som observerats i DN. Vidare har kliniska studier visat att insulinresistens korrelerar med uppkomsten och svårighetsgraden av albuminuri även hos normotensiva patienter som inte har diabetes, vilket tyder på att insulinresistens i sig kan orsaka albuminuri.42 Likaså möss med podocytspecifik insulinresistens, som uppnås genom att villkorad knockout av insulinreceptorn i glomerulära podocyter, utvecklade albuminuri och glomerulära lesioner som rekapitulerar DN, trots frånvaron av hyperglykemi eller diabetes.41 Omvänt, hos diabetiska djur kan insulinsensibilisatorer bromsa utvecklingen av DN oberoende av glykemisk kontroll.43 Dessa fynd tyder på att insulinsignalering reglerar podocytfunktionen oberoende av blodsockernivåerna. Men som nyckelomvandlaren för insulinsignaleringsvägen har rollen av GSK3b i patogenesen och progressionen av DN varit mycket understuderad.

I dennjure, GSK3b uttrycks övervägande i podocyter och, i mindre utsträckning, i mesangiala och endotelceller i glomerulus20,21 och uttrycks i stor utsträckning av njurtubulära celler. Det finns data från våra och andra grupper som indikerar att GSK3b förmedlar autonom podocytskada genom att integrera flera podociska topatiska signalvägar.17,20,44,45 Inkonsekvens, genetisk eller farmakologisk blockad av GSK3b kan skydda mot podocytskada och dämpa proteinuri i djurmodeller olika icke-diabetiska glomerulopatier.21 Dessutom, i progressivakronisknjuresjukdom, GSK3b visade sig vara en modulator av njurtubulär och interstitiell skada. Huruvida och hur GSK3b är involverat i DN har dock varit osäkert och intensivt kontroversiellt, även om den aktuella studien visade att förbättrad GSK3b-aktivering injureoch i urinexfolierade celler kan vara associerade med utveckling eller progression av DKD. Till exempel, hos råttor med streptozotocin-inducerad diabetes fann Lin et al.46 att hämningen av GSK3b av adenosintrifosfat-kompetitiv hämmare (20 Z,30 E)-6- brom i indirubin-30 -oxim ( BIO) försvagade proteinuri och förbättrade glomerulära lesioner av DN i frånvaro av korrigering av hyperglykemi, vilket tyder på att GSK3b spelar en skadlig roll i DN. Hos råttor med streptozotocininducerad diabetes gjorde Paeng et al.22 liknande fynd genom att använda BIO och drog slutsatsen att ökad GSK3b-aktivitet i podocyter under diabetiska tillstånd är associerad med podocytapoptos och förlust i DN. Detta stämmer överens med en annan in vitro-studie, där GSK3b visade sig förmedla podocytdedifferentiering och skada efter exponering för ett medium med hög glukosnivå.47 Tvärtom hävdade Mariappan et al.48 att aktiveringen av GSK3b istället förbättrar diabetesinduceradnjureskada. I deras studie behandlades streptozotocin-inducerade diabetiska möss med natriumnitroprussid, en kväveoxiddonator som kan aktivera GSK3b. De fann att albuminuri, njurhypertrofi och extracellulär matrixackumulering i glomeruli alla förbättrades i frånvaro av förbättring av hypertoni eller hyperglykemi. Dessa fynd motsäger dock skarpt data från geninriktade knock-in möss med konstitutivt aktiv GSK3 som utvecklade spontan albuminuri och podocytskada.49 För att förena de motstridiga fynden bör man vara försiktig med att tolka data som genereras genom att använda kemiska hämmare eller aktivatorer. av GSK3b. Även om BIO upprepade gånger har bekräftats vara en mycket selektiv hämmare av GSK3b med små molekyler, är natriumnitroprussid inte en specifik aktivator av GSK3b utan känd för att ha en potent hemodynamisk effekt,50 vilket sannolikt kommer att förväxla dess albuminuri-reducerande och renoskyddande verkan i diabetiska möss. Sammantaget, trots vissa motstridiga uppgifter, tenderar rådande bevis att stödja att GSK3b sannolikt är associerad mednjureskadaoch proteinuri i DN. Ett par begränsningar av föreliggande studie måste nämnas. För det första var de prekliniska data endast begränsade till DB/DB murina modeller. För att bestämma generaliserbarheten av rollen för GSK3b idiabetisk njurskada, är det nödvändigt att validera resultaten i andra modeller av DN, inklusive typ 1 DN-modeller. För det andra härleddes de kliniska observationerna här från retrospektiva kohorter av diabetespatienter med begränsad urvalsstorlek och en relativt kort uppföljningstid. Visserligen krävs storskaliga, prospektiva, randomiserade, multicenterstudier för att verifiera våra observationer och för att bekräfta kraften hos GSK3b i urinexfolierade celler för att förutsäga resultatet av DKD.

GSK3b, ett mycket konserverat, redoxkänsligt serin/treonin-proteinkinas, är centralt involverat i insulinsignalering såväl som ett antal andra cellulära signalvägar som är avgörande för patofysiologiska processer relaterade tillnjureskada, reparation och regenerering. I insulinkänsliga vävnader, såsom levern och skelettmuskulaturen, är GSK3b aktivt under basala förhållanden och undertrycker aktiviteten av glykogensyntas.19,28 Insulin inaktiverar snabbt GSK3b via hämmande fosforylering vid serin 9, vilket resulterar i glykogenbiosyntes. En växande mängd bevis tyder på att GSK3b-dysreglering är associerad med typ 2-diabetes mellitus.19,29–31 Det finns faktiskt data som indikerar GSK3b-överuttryck och hyperaktivitet i muskler hos diabetespatienter31–33 och i fettvävnader hos feta diabetiska möss.34 Dessutom , transgent överuttryck av GSK3b i skelettmuskler hos möss orsakar försämrad glukostolerans, insulinresistens och hyperinsulinemi.29,35 Omvänt uppvisar möss som saknar GSK3b i skelettmuskler förbättrad glukostolerans.36 Konsekvent kan GSK3-hämmare, t.ex. litium, efterlikna insulin

verkan i cellinjer och vävnader.37 Dessutom, hos överviktiga diabetiska möss, förbättrade GSK3-hämmare insulinkänsligheten och glukoshomeostasen.38 Njuren har traditionellt sett inte ansetts vara ett målorgan för insulinverkan. Men övertygande bevis tydde nyligen på att insulinsignalering i njurceller, särskilt i podocyter, spelar en nyckelroll för att upprätthålla glomerulär och njurhomeostas.39–41 Defekt insulinsignalering i podocyter, på grund av insulinbrist eller -resistens, är sannolikt en avgörande initiator. för många av de patologiska lesioner som observerats i DN. Vidare har kliniska studier visat att insulinresistens korrelerar med uppkomsten och svårighetsgraden av albuminuri även hos normotensiva patienter som inte har diabetes, vilket tyder på att insulinresistens i sig kan orsaka albuminuri.42 Likaså möss med podocytspecifik insulinresistens, som uppnås genom att villkorad knockout av insulinreceptorn i glomerulära podocyter, utvecklade albuminuri och glomerulära lesioner som rekapitulerar DN, trots frånvaron av hyperglykemi eller diabetes.41 Omvänt, hos diabetiska djur kan insulinsensibilisatorer bromsa utvecklingen av DN oberoende av glykemisk kontroll.43 Dessa fynd tyder på att insulinsignalering reglerar podocytfunktionen oberoende av blodsockernivåerna. Men som nyckelomvandlaren för insulinsignaleringsvägen har rollen av GSK3b i patogenesen och progressionen av DN varit mycket understuderad.

I njuren uttrycks GSK3b övervägande i podocyter och, i mindre utsträckning, i mesangiala och endotelceller i glomerulus20,21 och uttrycks i stor utsträckning av njurtubulära celler. Det finns data från våra och andra grupper som indikerar att GSK3b förmedlar autonom podocytskada genom att integrera flera patiska signalvägar för podocyter.17,20,44,45 Inkonsekvens, genetisk eller farmakologisk blockad av GSK3b kan skydda mot podocytskada och dämpa proteinuri i djurmodeller olika icke-diabetiska glomerulopatier.21 Dessutom i progressiv kronisknjuresjukdom, GSK3b visade sig vara en modulator av njurtubulär och interstitiell skada. Huruvida och hur GSK3b är involverat i DN har dock varit osäkert och intensivt kontroversiellt, även om den aktuella studien visade att förbättrad GSK3b-aktivering i njurarna och i urinexfolierade celler kan vara associerad med utvecklingen eller progressionen av DKD. Till exempel, hos råttor med streptozotocininducerad diabetes fann Lin et al.46 att hämningen av GSK3b av adenosintrifosfat-kompetitiv hämmare (20 Z,30 E)-6- brom i indirubin-30 -oxim ( BIO) försvagade proteinuri och förbättrade glomerulära lesioner av DN i frånvaro av korrigering av hyperglykemi, vilket tyder på att GSK3b spelar en skadlig roll i DN. Hos råttor med streptozotocininducerad diabetes gjorde Paeng et al.22 liknande fynd genom att använda BIO och drog slutsatsen att ökad GSK3b-aktivitet i podocyter under diabetiska tillstånd är associerad med podocytapoptos och förlust i DN. Detta stämmer överens med en annan in vitro-studie, där GSK3b visade sig förmedla podocytdedifferentiering och skada efter exponering för ett medium med hög glukosnivå.47 Tvärtom hävdade Mariappan et al.48 att aktiveringen av GSK3b istället förbättrar diabetesinduceradnjureskada. I deras studie behandlades streptozotocin-inducerade diabetiska möss med natriumnitroprussid, en kväveoxiddonator som kan aktivera GSK3b. De fann att albuminuri, njurhypertrofi och extracellulär matrixackumulering i glomeruli alla förbättrades i frånvaro av förbättring av hypertoni eller hyperglykemi. Dessa fynd motsäger dock skarpt data från geninriktade knock-in möss med konstitutivt aktiv GSK3 som utvecklade spontan albuminuri och podocytskada.49 För att förena de motstridiga fynden bör man vara försiktig med att tolka data som genereras genom att använda kemiska hämmare eller aktivatorer. av GSK3b. Även om BIO upprepade gånger har bekräftats vara en mycket selektiv hämmare av GSK3b med små molekyler, är natriumnitroprussid inte en specifik aktivator av GSK3b utan känd för att ha en potent hemodynamisk effekt,50 vilket sannolikt kommer att förväxla dess albuminuri-reducerande och renoskyddande verkan i diabetiska möss. Sammantaget, trots vissa motstridiga uppgifter, tenderar rådande bevis att stödja att GSK3b sannolikt är associerad mednjureskadaoch proteinuri i DN. Ett par begränsningar av

nuvarande studie måste nämnas. För det första var de prekliniska data endast begränsade till dB/dB murina modeller. För att bestämma generaliserbarheten av rollen för GSK3b idiabetisk njurskada, är det nödvändigt att validera resultaten i andra modeller av DN, inklusive typ 1 DN-modeller. För det andra härleddes de kliniska observationerna här från retrospektiva kohorter av diabetespatienter med begränsad urvalsstorlek och en relativt kort uppföljningstid. Visserligen krävs storskaliga, prospektiva, randomiserade, multicenterstudier för att verifiera våra observationer och för att bekräfta kraften hos GSK3b i urinexfolierade celler för att förutsäga resultatet av DKD.

Sammanfattningsvis visade våra studier att njurexpression och aktivitet av GSK3b förstärks i experimentell och klinisk DN. GSK3b-aktivitet i exfolierade urinceller kan fungera som en ny biomarkör för att förutsäga utvecklingen av DN. Våra data kan bana väg för en storskalig, djupgående undersökning av värdet som GSK3b i urinexfolierade celler kan fungera som en prognostisk biomarkör för DN.

METODER

Djurstudier

Djurstudier godkändes av Institutional Animal Care and Committee, och de överensstämmer med det amerikanska jordbruksdepartementets förordningar och National Institutes of Health's Guide for human Care and Use of Laboratory Animals. DB/DB-möss av hankön och kontroll db/m-kullkamrater i åldern 6 veckor köptes från NanjingUniversity Model Animal Research Center (Nanjing, Kina) och inhystes i Central Animal Facility vid Zhengzhou University. Alla möss matades ad libitum och 8 till 10 möss dödades vid angivna åldrar. Urin- och blodprover togs vid angivna tidpunkter. Efter avlivningen skördades njurarna för vidare undersökning. Urinalbuminnivåer mättes med användning av ett musalbuminenzymkopplat immunosorbentanalyskvantifieringskit (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Urinkreatininnivåer bestämdes med användning av ett kreatininanalyskit (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Cell kultur

Villkorligt immortaliserade muspodocyter mellan passagerna 21 och 25 odlades i Roswell Park Memorial Institute 1640-medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum under tillåtande förhållanden som beskrivits tidigare.22 Subkulturer av podocyterna utsattes för icke-tillåtande betingelser för att inducera differentiering i 14 dagar och var exponeras sedan för en normal miljö/odlingsmedium som innehöll 5 mM glukos, en diabetisk miljö bestående av glukos (25 mM) och transformerande tillväxtfaktor b1 (2 ng/ml), eller ett kontrollmedium med hög osmolalitet innehållande 20 mM mannitol för 48 timmar. Murina proximala tubulära epitelceller och glomerulära mesangialceller från mus bibehölls i Dulbeccos modifierade Eagles medium/F12 kompletterat med 5 procent fetalt bovint serum. Celler ströks ut vid w70 procent sammanflöde i mediet innehållande 5 procent fetalt bovint serum under 24 timmar och genomgick sedan serumsvält i ytterligare 24 timmar följt av exponering för en normal miljö/odlingsmedium som innehöll 5 mM glukos, en diabetisk miljö bestående av hög glukos (25 mM) och transformerande tillväxtfaktor b1 (2 ng/ml), eller ett kontrollmedium med hög osmolalitet innehållande 5 mM glukos och 20 mM mannitol under 48 timmar. Cellviabilitet bedömdes genom uteslutning av trypanblått. Vid angivna tidpunkter fixerades celler eller cellysat samlades in för ytterligare undersökning.

Transient transfektion av vektorer

Vektorerna som kodar för tom vektor eller hemagglutinin (HA)-märkt konstitutivt aktiv (S9A) mutant (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) av GSK3b tillhandahölls av Dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) och transfekterades till odlade podocyter, mesangiala celler och tubulära epitelceller genom att använda Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) som tidigare beskrivits.44 Transfektionseffektivitet verifierades genom immunfluorescensfärgning eller immunoblotting för HA efter 12 timmar. Celler samlades därefter in och preparerades för Western blot-analys eller andra analyser.

RNAi

En pool av 3 möss GSK3b-specifika små, störande RNA-duplex—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 och 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 — designades och syntetiserades enligt den fullständiga kodningssekvensen för den murina GSK3b-genen (GenBank accessionsnr. BC060743.1). Dessutom användes en förvrängd liten, störande RNA-sekvens (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUTt-30) utan sekvenslikhet med några kända gensekvenser från möss, råttor eller människor som kontroll för RNAi. Effektiviteten av lipofektamin (Invitrogen, Carlsbad, CA) -medierad gentystnad bedömdes genom immunoblotanalys för GSK3b. Tillfredsställande undertryckande av GSK3b-proteinuttryck observerades i odlade podocyter, mesangiala celler och tubulära epitelceller 24 timmar efter RNAi. Celler utsattes sedan för en normal miljö/odlingsmedium, en diabetisk miljö eller ett kontrollmedium med hög osmolalitet under 48 timmar såsom anges ovan innan cellerna bearbetades för ytterligare analyser.

Kliniska studier

Den kliniska delen av denna studie överensstämde med de etiska riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen 1975 och godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid Zhengzhouuniversitetets första anslutna sjukhus. Mänskliga forskningsdeltagare rekryterades inte specifikt för denna studie. Alla kliniska data insamlades genom retrospektiv kartgranskning och genom undersökning av arkiverade vävnadssektioner eller uppsatta urinprover. Överdrivna eller kasserade njurbiopsiprover, såväl som fraktionerade urinprover, har rutinmässigt deponerats vid Institute of Nephrology vid det första affilierade sjukhuset vid Zhengzhou University. Arkiverade oidentifierade formalinfixerade paraffininbäddade njurbiopsivävnader från patienter i olika stadier av DN valdes slumpmässigt ut för undersökning. Ytterligare njurprover utan histomorfologiska lesioner anskaffades från njurar som kasserats för transplantation på grund av vaskulära anomalier eller från preimplantationsbiopsivävnader och fungerade som normala kontroller. För den retrospektiva kohortstudien screenades totalt 127 patienter med typ 2-diabetes mellitus, som hade följts upp sedan 2010 med bankprover av fraktionerad urin, retrospektivt för inkludering i denna studie. De studerade patienterna var mellan 29 och 80 år och diagnostiserades med typ 2-diabetes enligt American Diabetes Associations kriterier. Uteslutningskriterier inkluderade förlust av uppföljning, otillräcklig information,njuredysfunktion, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 år. Under rutinuppföljning dokumenterades demografiska data, såväl som kliniska parametrar, inklusive kön, ålder, komorbiditeter, mediciner, diabetesvaraktighet, blodtryck, glykemisk nivå, serumkreatininnivå, urinanalysdata, UAE och eGFR. Det kliniska resultatet efter 5 års uppföljning var närvaro eller frånvaro av progression av nedsatt njurfunktion, vilket definierades som antingen 25 procents minskning av eGFR eller progression av albuminuri, vilket indikeras av eskaleringen av svårighetsgraden av albuminuri längs olika kliniska stadier av DN, det vill säga normoalbuminuri, mikroalbuminuri, makroalbuminuri eller öppen proteinuri. Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke.

Utvärdering av njurmorfologi och immunhistokemianalys

Paraffininbäddade formalinfixerade musnjurvävnadsblock skars i 3-mm sektioner. För allmän histologi bearbetades sektioner för perjodsyra-Schiff-färgning. Immunhistokemisk färgning för GSK3b och p-GSK3b utfördes med användning av ett VECTASTAIN ABC-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) som beskrivits tidigare.20 Som en negativ kontroll ersattes den primära antikroppen med icke-immun serum från samma art; ingen färgning inträffade. De morfologiska egenskaperna hos alla sektioner bedömdes av en enda observatör på ett förblindat sätt med hjälp av en njurpatolog.

Immunfluorescerande färgning

Odlade celler eller frysta kryostatsektioner fixerades och färgades med primära antikroppar och följdes av applicering av Alexa Fluor-konjugerade sekundära antikroppar (Invitrogen). Som en negativ kontroll ersattes primära antikroppar med preimmun IgG från samma art; ingen färgning inträffade. Slutligen motfärgades sektioner med 40,6-diamidino-2-fenylindol eller propidiumjodid och monterades med VECTASHIELD monteringsmedium (Vector Laboratories). För FL-fluorescensmikroskopi analyserades alla sektioner samtidigt för att utesluta artefakter på grund av varierande sönderfall av fluorokromen. Sektioner undersöktes med användning av ett Olympus FL fluorescensmikroskop utrustat med en Spot II digitalkamera (Olympus, Tokyo, Japan). För tvåfärgsfärgning togs bilder sekventiellt för att undvika färgämnesinterferens. ImageJ programvara (National Institutes of Health, Bethesda, MD) användes för efterbearbetning av bilderna, till exempel skalning, sammanslagning och samlokaliseringsanalys.

Datoriserad morfometri

Bilder av immunhistokemifärgning togs och digitaliserades med hjälp av ett datoriserat bildanalyssystem bestående av en högupplöst laddningskopplad digitalkamera kopplad till ett mikroskop (Olympus BX41, Olympus) och till en dator. Bilderna visades med en pixelupplösning på 1024 768 pixlar (spatial upplösning, 0,24 mm/pixel). För bilder av immunhistokemifärgning av mänskliga njurvävnader användes ImageJ-programvaran för bildsegmentering, tröskeletablering och mätningar av signalintensitet. Manuella korrigeringar utfördes vid behov. Totalt togs 10 glomeruli eller 10 slumpmässiga tubulointerstitialfält för morfometrisk analys, och de slutliga data uttrycktes som värdet av integrerad pixeltäthet i förhållande till kontrollgruppen.

Western immunoblotanalys

Odlade celler lyserades;njurevävnadereller isolerade renala glomeruli homogeniserades i radioimmunoutfällningsanalysbuffert kompletterad med proteashämmare, och prover bearbetades för immunoblotanalys. För immunoblotanalys av det begränsade antalet exfolierade celler i urinen modifierades protokollet för Western blot som beskrivits tidigare genom att använda de högpresterande NuPAGE Bis-Tris Gels (Invitrogen) och högkvalitativa överföringsmembran.25 Raffinerad immunoblotting kunde upptäcka måttligt uttryckta proteiner i så få som 1000 celler. Antikropparna mot GSK3b, fibronektin, kollagen IV, aktin och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) köptes från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); de mot synaptopodin köptes från PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Tyskland); och de mot ZO-1 och p-GSK3b förvärvades från Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Statistisk analys

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 jämförelser. Kategoriska data jämfördes mellan grupper med hjälp av chi-kvadrattestet. Linjär regressionsanalys användes för att undersöka möjliga samband mellan 2 parametrar. Univariate Cox proportional hazards regressionsanalyser utfördes för att bedöma sambanden mellan de relevanta variablerna och risken för progression av nedsatt njurfunktion, följt av multivariata analyser med avseende på potentiella konfounders. ROC-kurvanalys utfördes och områdena under ROC-kurvorna mättes för att analysera styrkan hos vissa variabler för att förutsäga utvecklingen av nedsatt njurfunktion hos diabetespatienter. Icke-normalfördelade variabler, såsom UAE, transformerades med logaritm för att uppnå normalitet för Cox-andelen risker regressionsanalyser ROC kurvanalyser. Alla statistiska analyser utfördes med PSS version 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P-värden<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

AVSLÖJANDE

Alla författarna deklarerade inga konkurrerande intressen.

TACK

En del av denna studie presenterades som en muntlig presentation vid KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15–20 november 2016, Chicago, IL. RG stöddes delvis av stiftelsen för hälsa. XL fick stöd av ett forskarstipendium för att få extramural utbildning. ZL stöddes av National NaturalScience Foundation of China anslag U1604284, 81770672 och 81873612. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen och genomförandet av denna studie, insamling och tolkning av data eller förberedelse och godkännande av manuskriptet.

FÖRFATTARBIDRAG

RG tog fram de konceptuella idéerna. XL, ZL och RG bidrog till studiedesignen. XL, PW, BC, YG, AYG och BF utförde cellodlingsexperimenten. XL och ZL utförde djurexperimenten och samlade in data från diabetespatienter. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, och bidrog till diskussionen och tolkningen av resultaten. tog ledningen för att skriva manuskriptet. XL, BC och BF bidrog till manuskriptredigering. Alla författare var överens om att hela konceptet och ägandet av detta verk tillhör RG. Alla författare godkände det slutliga manuskriptet.

EXTRAMATERIAL

Kompletterande metoder.

Tabell S1. Egenskaper hos kontrollpersoner och patienter med diabetisk nefropati, stratifierade enligt histologiska klasser av diabetisk nefropati. Tabell S2. Demografiska, kliniska och laboratoriedata från den retrospektiva kohorten av diabetespatienter i tidigt stadium utan tecken på DKD. Tabell S3. Demografiska, kliniska och laboratoriedata från patienter med typ 2-diabetes i tidigt stadium, stratifierade enligt deras njurresultat efter 5 års uppföljning. Figur S1. Den ökade njuraktiviteten hos GSK3b förutsäger utvecklingen och svårighetsgraden avdiabetikernjuresjukdomi db/db möss. Manliga db/db och db/m möss följdes upp mellan 4 och 13 veckors ålder. (A) Blod togs från icke-fastande möss vid 4 och 7 veckors ålder, och plasmaglukosnivåer analyserades. *P < 0.001="" mot="" db/m="" möss="" vid="" 7="" veckors="" ålder.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" urinprov="" togs="" vid="" 4,="" 7,="" 10="" och="" 13="" veckors="" ålder="" och="" utsattes="" för="" urinalbumin="" och="" urinkreatininanalys="" för="" bestämning="" av="" urinalbumin-till-kreatinin-förhållanden="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" mot="" db/m="" möss="" vid="" 10="" veckors="" ålder="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p="">< 0,001="" mot="" db/m="" möss="" vid="" 13="" veckors="" ålder.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" alla="" möss="" fick="" öppen="" njurbiopsi="" vid="" 7="" veckors="" ålder="" och="" biopsiprover="" bearbetades="" för="" immunoblotanalys="" för="" p-gsk3b,="" gsk3b="" och="" gapdh.="" (d)="" immunoblots="" utsattes="" för="" densitometrisk="" analys.="" den="" relativa="" förekomsten="" av="" gsk3b="" och="" p-gsk3b="" bestämdes="" som="" densitometriska="" förhållanden="" av="" respektive="" molekyl/gapdh="" som="" veckändringar="" jämfört="" med="" kontroll="" db/m="" möss.="" den="" relativa="" aktiviteten="" för="" gsk3b="" beräknades="" som="" förhållanden="" av="" p="" gsk3b="" till="" gsk3b="" som="" veck="" av="" kontroll="" db/m="" möss.="" (e)="" linjär="" regressionsanalys="" visade="" en="" statistiskt="" signifikant="" positiv="" korrelation="" mellan="" renal="" gsk3b-aktivitet="" vid="" 7="" veckors="" ålder="" hos="" db/db-möss="" och="" utvecklingen="" och="" svårighetsgraden="" av="" albuminuri,="" ett="" kännetecken="">diabetikernjuresjukdomvid 13 veckors ålder. R ¼ 0.699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Analys av mottagarens funktionskarakteristiska kurva visade att renal GSK3b-aktivitet i tidiga stadier av diabetes (7 veckors ålder) ger utmärkt noggrannhet och kraft för att förutsäga utvecklingen av albuminuri och DKD vid 13 veckors ålder hos db/db-möss. Figur S2. Insulinresistens och hög omgivande glukos aktiverar synergistiskt GSK3b i njurceller. (A) Odlade murina podocyter, (B) urin glomerulära mesangialceller (MMC) och (C) renala tubulära epitelceller (TEC) transfekterades med förvrängda siRNA-oligonukleotider (siCon) eller siRNA-oligonukleotider (siIRb) specifika för b-isoformen insulinreceptorn (IRB) för att modellera tillståndet för insulinresistens in vitro. Celler exponerades sedan under 48 timmar för den normala glukoshaltiga normala miljön (NG) eller den högglukoshaltiga diabetiska miljön (HG). Cellysat uppsamlades och utsattes för immunoblotanalys för IRB, p-GSK3b, GSK3b och GAPDH följt av densitometrisk analys av blottarna. *P < 0,01="" mot="" irb-uttryck="" i="" sicon-behandlade="" celler="" exponerade="" för="" samma="" miljö="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" mot="" samma="" proteinuttryck="" i="" siirb="" þ="" ng-="" eller="" sicon="" þ="" hg-gruppen="" (n="" ¼="" 3),="" &p="">< 0,05="" mot="" samma="" proteinuttryck="" i="" den="" andra="" þ="" hg-="" eller="" siirb="" þ="" ng-gruppen="" (n="" ¼="" 3).="" bild="" s3.="" uttrycksnivåer="" av="" gsk3b-mrna="" i="" humana="" njureprover="" från="" friska="" levande="" donatorer="" och="" patienter="" med="" diabetisk="" nefropati.="" data="" härleddes="" från="" www.nephroseq.org="" på="" basis="" av="" ju="" ckd="" glom="" dataset51="" och="" uttrycks="" som="" log2="" mediancentrerad="" intensitet.="" bild="" s4.="" förbättrad="" aktivitet="" av="" gsk3b="" i="" urinexfolierade="" celler="" som="" samlats="" in="" från="" diabetespatienter="" i="" tidigt="" stadium="" förutsäger="" utvecklingen="" av="" diabetisk="" njursjukdom.="" (a,="" b)="" detektion="" av="" gsk3b="" och="" aktiverat="" gsk3b="" i="" urinexfolierade="" celler="" som="" samlats="" in="" från="" diabetespatienter="" i="" tidigt="" stadium="" (pts)="" och="" friska="" kontroller="" (ctrls).="" urinexfolierade="" celler="" uppsamlades="" och="" lyserades.="" cellysat="" bearbetades="" för="" immunoblotanalys="" för="" gsk3b,="" p-gsk3b="" och="" gapdh.="" (c)="" immunoblots="" utsattes="" för="" densitometrisk="" analys.="" den="" relativa="" förekomsten="" av="" gsk3b="" och="" p-gsk3b="" bestämdes="" som="" densitometriska="" förhållanden="" av="" respektive="" molekyl/gapdh="" som="" veckändringar="" jämfört="" med="" kontroller="" (ctrls).="" den="" relativa="" aktiviteten="" för="" gsk3b="" beräknades="" som="" förhållanden="" mellan="" p-gsk3b="" och="" gsk3b="" som="" veck="" av="" normal="" kontroll="" (ctrls).="" (d)="" analys="" av="" mottagarens="" funktionskarakteristiska="" kurva="" visade="" att="" den="" relativa="" gsk3b-aktiviteten="" (p-gsk3b/gsk3b-förhållande)="" i="" urinexfolierade="" celler="" insamlade="" från="" diabetespatienter="" i="" tidigt="" stadium="" ger="" utmärkt="" noggrannhet="" i="" att="" förutsäga="" utvecklingen="">diabetisk njursjukdomom 5 år, där arean under kurvan (AUC) är 0.886.

REFERENSER

1. Umanath K, Lewis JB. Uppdatering om Diabetic Nephropathy: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Förändringar i diabetesrelaterade komplikationer i USA, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan för fördröjning eller förebyggande av mikroalbuminuri vid typ 2-diabetes. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Patogenetiska mekanismer för diabetisk nefropati. J Am Soc Nephrol. 2005;16(suppl 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Klinisk manifestation och naturlig historia av diabetisk nefropati. Bidra Nephrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-årsuppföljning av intensiv glukoskontroll vid typ 2-diabetes. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, et al. Mikroalbuminuri och risken för tidig progressiv njurfunktionsnedgång vid typ 1-diabetes. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Risk för progression av normoalbuminurisk CKD till njursjukdom i slutstadiet hos personer med diabetes: CRIC-studien (Chronic Renal Insufficiency Cohort). Am J Kidney Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Behovet av tidiga prediktorer för risk för diabetisk nefropati: är albuminutsöndringshastigheten tillräcklig? Diabetes. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Låg glomerulär filtreringshastighet hos normoalbuminuriska typ 1-diabetespatienter: en indikator på mer avancerade glomerulära lesioner. Diabetes. 2003;52:1036–1040.

11. Krolewski AS. Progressiv njurnedgång: det nya paradigmet för diabetisk nefropati vid typ 1-diabetes. Diabetesvård. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Icke-proteinurisk diabetisk nefropati. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Utveckling och progression av nefropati vid typ 2-diabetes: United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS 64). Kidney Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Urinbiomarkörer vid bedömning av tidig diabetisk nefropati. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, et al. Urin IgG4 och Smad1 är specifika biomarkörer för njurstrukturella och funktionella förändringar i de tidiga stadierna av diabetisk nefropati. Diabetes. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Exocytosmedierad utsöndring av megalin i full längd i urin är kopplad till patogenesen av diabetisk nefropati. Diabetes. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. Glykogensyntaskinas 3b dikterar podocytmotilitet och fokal adhesionsomsättning genom att modulera paxillinaktivitet: implikationer för den skyddande effekten av lågdos litium vid podocytopati. Am J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glykogensyntaskinas-3: egenskaper, funktioner och reglering. Chem Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glykogensyntaskinas-3 (GSK3): reglering, verkan och sjukdomar. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. b-isoformen av GSK3 förmedlar autonom podocytskada vid proteinurisk glomerulopati. J Pathol. 2016;239:23.