Förutsäg rollen av LncRNA i njuråldring baserat på RNA-sekvensering Ⅱ

Korrelation av lncRNA Gm43360 och dess potentiella mål-mRNA

LncRNA Gm43360 valdes ut för studie eftersom det kopplade samman två lncRNA-mRNA-samuttrycksnätverk. Uttrycksnivån för Adra1a var positivt korrelerad (rho=0.8650, p=0.026) med den för Gm43360, Csnk1a1 (kaseinkinas 1A1) var negativt korrelerad (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (Fig. 5a). För att ytterligare verifiera korrelationen mellan lncRNA Gm43360 och dess potentiella mål-mRNA Adra1a och Csnk1a1, designades en överuttrycksplasmid av lncRNA Gm43360 i denna studie. Uttrycket av Csnk1a1 minskade som förväntat, och Adra1a-uttrycket minskade också, men inte signifikant. Därefter slog vi ner lncRNA Gm43360 av siRNA för att upptäcka om uttrycket av dess mål-mRNA påverkades. Som väntat ökade Csnk1a1 i lncRNA Gm43360 knockdown-celler i förhållande till siRNA-negativa kontrollgruppen (Fig. 5b). Tio upptäckte vi rollen av lncRNA Gm43360 i cellcykeln. Resultaten från cellräkningssatsen-8 (CCK-8) visade att lncRNA Gm43360 främjade cellviabilitet (Fig. 5c). Resultaten visade att lncRNA Gm43360 ökade andelen S-fasceller och minskade procentandelen G1-fasceller jämfört med den negativa kontrollen (Fig. 5d). Te p53- och p21-proteiner var involverade i regleringen av cellcykeln och var således tecken på cellåldring. Expressionsnivåerna av p53 och p21 minskade signifikant i överuttrycksgruppen jämfört med kontrollgruppen. Expressionsnivåerna av p53 och p21 ökade signifikant i siRNA-gruppen i förhållande till siRNA-kontrollgruppen (Fig. 5e). Överuttryck av lncRNA Gm43360 minskade antalet SA- -gal-positiva celler och -gal-positiva celler ökade i gruppen av transfekterade Gm43360 (Fig. 5f). Sammantaget indikerade dessa resultat att lncRNA Gm43360 hämmade åldrandet av tubulära njurepitelceller genom atthämmar uttrycket av Csnk1a1.

KLICKA HÄR FÖR ATT FÅ NATURLIGT EKOLOGISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 25% ECHINACOSID OCH 9% ACTEOSIDE FÖR NJURFUNKTION

Diskussion

I denna studie utvärderade vi mRNA-uttrycksdata från unga och gamla musnjurar och genomförde bioinformationsanalyser som avslöjade funktionerna hos de avvikande uttryckta mRNA:erna. Vi observerade 347 uppreglerade mRNA och 355 nedreglerade mRNA såväl som 130 uppreglerade lncRNA och 91 nedreglerade lncRNA igamla musnjurar jämfört med unga musnjurar. Dessutom visades dessa mRNA vara involverade i åldringsrelaterade vägar, som t.exoxidativ fosforylering, AMPK-signalvägen, Wnt-signalvägen, Rap1-signalvägen och åldersrelaterad sjukdom, som visade funktionerna hos differentiellt uttryckta mRNA i patogenesen av njuråldrande.

Det långa icke-kodande RNA NEAT1 är en skyddande faktor i utvecklingen av njurfibros i njurtubulära epitelceller [21]. Av en slump, i våra sekvenseringsresultat, uttrycktes lncRNA NEAT1 vid lägre nivåer i njurarna hos åldrade möss än hos unga möss, vilket överensstämmer med tidigare fynd. LincRNA-Gm4419 accelererar inflammation och fibros genom NF-kB/NLRP3 inflammasommedierade mekanismer vid diabetisk nefropati [22]. I våra sekvenseringsresultat fann vi också att uttrycket av Gm4419 var högre i njurarna hos åldrade möss än hos unga möss, men det fanns ingen signifikant skillnad. LncRNA Gm43360 finns på kromosom 5 (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp). Enligt UCSC Genome Browser är Gm43360 beläget i intronet av den proteinkodande genen Atp2a2. Det har dock inte förekommit några rapporter om inblandning av lncRNA Gm43360 i sjukdomar hittills. I denna studie främjade nedbrytningen av lncRNA Gm43360 åldrande av tubulära epitelceller i njurarna. Dessutom identifierade vi många differentiellt uttryckta lncRNA i sekvenseringsresultaten och undersökte dem.

LncRNA klassificerades i cis-reglering eller trans-reglering baserat på lncRNA-regleringsmekanismer. Cis-verkande lncRNA kan påverka uttrycket av närliggande gener genom att vara beroende av cis-verkande element, såsom promotorer, förstärkare och regulatoriska sekvenser, som är avstånd mellan lncRNA och mRNA på mindre än 100 kb. Transagerande lncRNA hänvisar till lncRNA som lämnar transfektionsstället och verkar på avlägsna platser (dvs avståndet mellan lncRNA och mRNA är mer än 100 kb) [23]. LncRNA MAAT ökar uttrycket av den närliggande genen Mbnl1 genom en cis-regulatorisk modul [24]. LncRNA Pnky spelar en roll som en transagerande regulator i kortikal utveckling [25]. I denna studie fanns det ett transregulatoriskt förhållande mellan lncRNA Gm43360 och Csnk1a1. Csnk1a1 är en tumörsuppressorgen [26] som kodar för ett protein som deltar i cellcykeln och celldelningsprocessen [27]. Csnk1a1 nedreglering induceraråldrande-associerad inflammatorisksvar med tillväxtstopp i kolorektala tumörer [26]. Csnk1a1 nedreglerades när Gm43360 uppreglerades; sålunda är det troligt att lncRNA Gm43360 deltar injurarnas åldrandeförbireglerar Csnk1a1-uttryck.

Slutsatser

Vår undersökning av lncRNA-mRNA-samuttrycksnätverket injurarnas åldrandeavslöjade ett lncRNA, lncRNA Gm43360, kan spela en skyddande roll vid åldrande av njurar och utökade vår förståelse för de mekanismer som är involverade injurarnas åldrande

Material och metoder

Prover Unga (3-månadsgamla) och gamla (24-månadsgamla) C57BL/6J-hanmöss köptes från Experimental Animal Center vid Xiamen University och växte upp i en standardmiljö. Alla möss hade fri tillgång till mat och vatten. Mössen acklimatiserades till den nya anläggningen i en månad innan de avlivades. Mössen bedövades med uretan genom intraperitoneal injektion i en dos av 750 mg/kg före provtagning. Unga och gamla möss avlivades samma dag.Kvarvarande musnjurevävnad användes för sekvensering i varje analys. RNA-seq och histopatologi utfördes påseparata njurarfrån samma mus. Njurvävnad uppsamlades från möss. En njure nedsänktes omedelbart i 10 % neutralt buffrat formalin för efterföljande sektionsinbäddning, och den andra njuren delades upp i flera vävnader och placerades omedelbart i flytande kväve och lagrades sedan vid -80 grad. Studien stöddes av etikkommittén vid det första anslutna sjukhuset vid Xi'an Jiaotong University (Shaanxi, Kina) (nr 2018-G-164). Alla metoder utfördes av de djuretiska riktlinjerna och föreskrifterna. Denna studie genomfördes i enlighet med ARRIVE-riktlinjerna.

Njurhistopatologi

Njurvävnadsprover från unga och gamla möss fixerades i 10% paraformaldehydlösning över natten. Tio av sektionerna var dehydrerade, paraffininbäddade och sektionerade med 4- µm tjocklek. PAS och Massons trikromatiska färgning utfördes med standardprotokoll. Bilderna togs med kameran och det färgningspositiva området mättes. Arean för histopatologikamerabilderna beräknades med Image-Pro Plus 6.0.

SA‑ ‑gal färgning

SA{0}}gal-aktiviteten analyserades med ett SA- -gal-färgningskit (Cell Signaling Technology #9860) enligt tillverkarens protokoll. Arean med positiv färgning mättes och SA- -gal-positiva celler beräknades med Image-Pro Plus 6.0.

Konstruktion och sekvensering av RNA-extraktionsbibliotek

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 användes för att konstruera ett sekvenseringsbibliotek. Efter extraktion av totalt RNA renades mRNA från totalt RNA (5 ug) med användning av Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) med två reningsomgångar. Efter rening delades mRNA:t i korta fragment med användning av tvåvärda katjoner vid höga temperaturer (Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, kat. e6150, USA) under 94 grader 5-7 min). Sedan transkriberades de kluvna RNA-fragmenten omvänt för att erhålla cDNA med SuperScript™ II omvänt transkriptas (Invitrogen, kat. 1 896 649, USA), som därefter användes för att syntetisera U-märkta andrasträngade DNA med E. coli DNA-polymeras I ( NEB, kat.m0209, USA), RNase H (NEB, kat.m0297, USA) och dUTP-lösning (Termo Fisher, kat.R0133, USA). En A-bas sattes sedan till de trubbiga ändarna av varje sträng, för att förbereda dem för ligering till de indexerade adaptrarna. Varje adapter innehöll ett T-basöverhäng för att ligera adaptern till det A-svansförsedda fragmenterade DNA:t. Dubbelindexadaptrar ligerades till fragmenten och storleksval utfördes med AMPureXP-pärlor. Efter den värmelabila UDG-enzymbehandlingen (NEB, kat.m0280, USA) av de U-märkta andra-strängade DNA:na amplifierades de ligerade produkterna med PCR under följande betingelser: initial denaturering vid 95 grader under 3 minuter; 8 cykler av denaturering vid 98 grader i 15 s, hybridisering vid 60 grader i 15 s och förlängning vid 72 grader i 30 s; och sedan sista förlängning vid 72 grader i 5 min. Den genomsnittliga insättningslängden för de slutliga cDNA-biblioteken var 300±50 bp. Slutligen utförde vi 2×150 bp parad-end-sekvensering (PE150) på en Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Kina) enligt tillverkarens protokoll [28].

Bioinformatikanalys Sekvens och filtrering av Clean Reads

Ett cDNA-bibliotek konstruerat med teknologi från poolat RNA frånnjurproverav möss sekvenserades och kördes med Illumina NovaseqTM 6000-sekvensplattformen. Med hjälp av Illumina-parade RNA-seq-tillvägagångssätt sekvenserade vi transkriptomet, vilket genererade totalt miljoner 2×150 bp parade ändar. Avläsningar som erhålls från sekvenseringsmaskinerna inkluderar råavläsningar som innehåller adaptrar eller baser av låg kvalitet som kommer att påverka följande montering och analys. För att få rena läsningar av hög kvalitet filtrerades läsningarna ytterligare av Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Parametrarna var följande:

1) ta bort läsningar som innehåller adaptrar;

2) ta bort läsningar som innehåller polyA och poly;

3) ta bort avläsningar innehållande mer än 5 % av okända nukleotider (N);

4) ta bort avläsningar av låg kvalitet som innehåller mer än 20 % av baser av låg kvalitet (Q-värde mindre än eller lika med 20).

Tio sekvenskvalitet verifierades med FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). inklusive Q20-, Q30- och GC-innehållet i rena data. Därefter producerades totalt G bp av rengjorda, parade avläsningar. Råsekvensdata har skickats till NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) datamängder med accessionsnummer GSE154223.

Referensgenomet/annoteringen var Mus_musculus.GRCm38. Källan och versionen av genanteckningen som användes för analyser var Ensembl_v88.

Avskrifter montering

För det första användes Cutadapt [29] för att ta bort läsningarna som innehöll adapterkontamination, baser av låg kvalitet och obestämda baser. Tio sekvenskvalitet var mycket matad med FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Vi använde Bowtie2 [31] och Hisat2 [32] för att kartlägga läsningar till genomet hos mus. De kartlagda läsningarna av varje prov sammanställdes med StringTie [33]. Tio, alla avskrifter frånnjurproverslogs samman för att rekonstruera ett omfattande transkriptom med hjälp av Perl-skript. Efter att det slutliga transkriptomet genererats användes StringTie [33] och edgeR [34] för att uppskatta uttrycksnivåerna för alla transkript.

LncRNA-identifiering

Först och främst kasserades transkript som överlappade med kända mRNA och transkript kortare än 200 bp. Sedan använde vi CPC [35] och CNCI [36] för att förutsäga transkript med kodningspotential. Alla avskrifter med CPC-poäng<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Analys av differentiellt uttryckta analysgener (DGE).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 ansågs differentiellt uttryckta gener.

Målgenförutsägelse och funktionell analys av lncRNA

För att utforska funktionen av lncRNAs funktion förutspådde vi cis-målgenerna för lncRNA. LncRNA kan spela en cis-roll när det gäller att verka på närliggande målgener. I denna studie valdes kodande gener i 100,000 uppströms och nedströms ut med Perl-skript. Sedan visade vi en funktionell analys av målgenerna för lncRNA genom att använda skripten BLAST2GO [39]. Den fullständiga kommandolänken till den offentliga domänen var Jie-Li/README.md på main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Genontologi (GO) kategorier och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analys

Den bioinformatiska analysen för RNA-sekvensering utfördes med hjälp av OmicStudio-verktyg (http://www.omicsudio. cn/tool). Gene Ontology (GO) funktionell anrikningsanalys och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [37-39] anrikningsanalys användes för att analysera de biologiska funktionerna hos de förutsagda målgenerna. GO-analys klargör de huvudsakliga biologiska processerna genom tre aspekter: cellsammansättning, molekylära funktioner och biologiska processer (http://www.geneontology.org/). Analysen lägger först alla differentiellt uttryckta gener och bakgrundsgener i GO-databasen. Varje objekt kartläggs, antalet gener i varje objekt beräknas och den hypergeometriska fördelningen används för att utföra hypotestestning för att erhålla P-värdet för anrikningsresultatet. Ju lägre P-värde, desto mer signifikant blir anrikningsresultatet. KEGG är en databasresurs som analyserar de differentiellt uttryckta mRNA:n genom genetisk biologi för att utforska viktiga vägar relaterade till målgener (https://www.genome.jp/kegg/). Resultaten uttrycks med p-värden; ju lägre p-värde, desto mer signifikant blir anrikningsresultatet.

qRT–PCR

GAPDH användes som endogen kontroll. Sedan beräknades de relativa uttrycksnivåerna för okända gener. Alla primers designades och syntetiserades specifikt för detta experiment. Primers för GAPDH har kommersialiserats. Specificiteten för Adra1a och Csnk1a1 primrar identifierades av den enda toppen av smältkurvan.

Bygg mRNA-lncRNA-samuttrycksnätverk

Transreglering baserades på forskning och sedan beräknades transenergin. Ju mindre transenergin var, desto större möjlighet till bindning. Sedan beräknades också korrelationskoefficienten för mRNA-lncRNA. mRNA-lncRNA-nätverket konstruerades genom att välja en Spearman-korrelationskoefficient som översteg 0.9. mRNA-lncRNA-samuttrycksnätverket konstruerades med användning av Cytoscape-mjukvaran (v3.7.1).

Cell kultur

Muss njurproximala tubulära epitelceller (MRPT-EpiCs) odlades i epitelcellsmedium-djur (EpiCM-a, Kat. #4131) innehållande 2 % fetalt nötkreatursserum (FBS, Kat. #0010) och Epitelcelltillväxttillägg-djur (EpiCGS-a, Kat. #4182) utan antibiotika i en fuktad inkubator vid 37 grader och 5% CO2. Odlingsmediet byttes varannan till var tredje dag. Cellerna i den logaritmiska tillväxtfasen sub-odlades när tillväxten nådde 90 %. Cellsuspensionen digererad med trypsin såddes i 6-brunnsplattor med 2*104 -5*104 celler i varje brunn. Cellerna som användes för transfektion var alla mellan generation 2 och 5.

Plasmidkonstruktion och celltransfektion

Överuttrycksplasmiden lncRNA Gm43360 konstruerades av GeneChem (Shanghai, Kina). Plasmidskelettet var GV658, och CMV-promotorn drev lncRNA-uttryck. Den klonade nukleotidsekvensen tillhandahålls i det kompletterande materialet. För lncRNA Gm43360 knockdown, MÅSTE tre lncRNA ENS00000197656-mål siRNA (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'CUCA-CCCUGUCA UGAAGUUTT-3'; och lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGTT-3') designades och syntetiserades vid GenePharma (Shanghai, Kina). Enligt tillverkarens protokoll transfekterades celler med 2500 ng plasmid eller 100 pmol siRNA med 6 µl Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, USA) per brunn. RNA- och proteinuttrycksnivåer detekterades 48 timmar efter transfektion och varje experiment upprepades minst tre gånger. Kvantitativ PCR i realtid användes för att validera effektiviteten av lncRNA Gm43360 överuttryck och knockdown.

Western blot-analys

Odlade celler tvättades med iskall PBS, 120 ul RIPA-buffert (Hjärta, Kina) tillsattes och proteashämmare och PMSF (Hjärta, Kina) tillsattes under 30 minuter på is. Efter insamling av celler i olika mikrocentrifugrör kvantifierades proteinkoncentrationen. Laddningsbuffert sattes till varje prov och kokades sedan i 7 min. Trettio mikrogram av provet separerades med 12% SDS-PAGE (Beyotime, Kina) och elektrotransfererades till PVDF-membran (Thermo Fisher, USA). Därefter blockerades membranen med 5% mjölk. Membranen inkuberades med specifika primära antikroppar: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) och anti-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) över natten vid 4 grader . Efter tvättning med TBST inkuberades membran med en sekundär antikropp under 1 timme vid rumstemperatur. Proteinband observerades med användning av ett kemiluminescenskit (Millipore, USA). Uttrycket av GAPDH användes för att normalisera proteinnivåer.

Cellproliferationsanalys

Cellproliferationskapaciteten bestämdes med cellräkningskit-8 (CCK-8)-analysen. Fyrtioåtta timmar efter transfektion sattes 90 µl nytt medium och 10 µl CCK-8-lösning till varje brunn (Beyotime, C0042). Cellerna inkuberades i 1–4 timmar vid 37 grader i 5% CO2 och mättes vid 450 nm av en universell mikroplattläsare (Bio-Tek, USA).

Flödescytometrisk analys

Celler ströks ut i 6-brunnsplattor dagen före transfektion. Fyrtioåtta timmar efter transfektion trypsiniserades cellerna och centrifugerades vid 1000 rpm under 5 min. Sedan fixerades cellerna i 70% etanol vid 4 grader i minst 4 timmar. Efter centrifugering tillsattes RNas A och propidiumjodid (PI) färgningslösning till cellerna, och cellerna inkuberades sedan i 30 minuter vid rumstemperatur i mörker. Te-färgade celler analyserades med en ACEA NovoCyte (Biosciences, USA).

Statistisk analys

Mätdata med normalfördelningen presenteras som medelvärde±SD. Skillnaden mellan de två olika grupperna bestämdes med hjälp av tvåsvansade oparade Students t-test, och ett p-värde < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Alla beräkningar utfördes med användning av GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

Referenser

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Cellulär senescens i njuren. J Am Soc Nephrol. 2019;30(5):726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Att möta de globala utmaningarna med åldrande. Natur. 2018;561(7721):45–56.

3. Pan JX. LncRNA H19 främjar ateroskleros genom att reglera MAPK och NF-kB signalvägar. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Långt icke-kodande RNA HOTAIR driver EZH2-beroende myofibroblastaktivering i systemisk skleros genom miRNA 34a-beroende aktivering av NOTCH. Ann Reumatic Dis. 2020;79(4):507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et al. LncRNA-p21 förändrar den antiandrogena enzalutamid-inducerade prostatacancer neuroendokrina differentieringen genom att modulera EZH2/STAT3-signaleringen. Nat Commun. 2019;10(1):2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et al. Ett nytt lncRNA MCM3AP-AS1 främjar tillväxten av hepatocellulärt karcinom genom att rikta in sig på miR-194-5p/FOXA1-axeln. Mol Cancer. 2019;18(1):28.

7. Wu YY, Kuo HC. Funktionella roller och nätverk av icke-kodande RNA i patogenesen av neurodegenerativa sjukdomar. J Biomed Sci. 2020;27(1):49.

8. Li Z, Wang Z. Åldrande njure och åldrande-relaterad sjukdom. Adv Experiment Med Biol. 2018;1086:169–87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Regel AD. Ålder, njurfunktion och riskfaktorer är olika associerade med kortikala och märgvolymer i njuren. Kidney Int. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR riktar sig mot miR-126-5p för att främja utvecklingen av Parkinsons sjukdom genom RAB3IP. Biol Chem. 2019;400(9):1217–28.

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop