Nuvarande status för neuroskydd vid medfödd hjärtsjukdom del 2

De mikroskopiska bilderna utsattes sedan för bildberäkning med hjälp av programvaran ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Signalen för Hsp60 multiplicerades med "x".

Hsp60 är en viktig proteinmolekyl som spelar en viktig biologisk roll i människokroppen. Forskning de senaste åren har visat att förekomsten av Hsp60 är nära relaterad till mänskligt minne.

Hsp60 är ett molekylärt chaperonprotein som huvudsakligen är involverat i proteinveckning, utveckning, stabilisering och nedbrytning. Dessa processer är mycket viktiga för normal metabolism och cellulär funktion i människokroppen. Samtidigt har Hsp60 också antioxiderande, antiinflammatoriska och immunmodulerande effekter och spelar en stor roll för att upprätthålla människors hälsa och balansen i immunsystemet.

Forskning har funnit att Hsp60 spelar en avgörande roll i minnesbildning och underhåll. Under processen med inlärning och minne producerar hjärnceller ett stort antal Hsp60-molekyler. Dessa molekyler kan skydda celler från störningar och skador från den yttre miljön för att säkerställa en smidig utveckling av inlärning och minne. Dessutom kan Hsp60 också påverka mänskligt tänkande och beteende genom att förändra signaltransduktionen av hjärnceller och utvecklingen av neuroner och har en positiv inverkan på kognition och stressmotstånd.

Även om Hsp60:s roll har visat positiva effekter på människokroppen, måste människor också inse att både överskott och brist på Hsp60 kan ha negativa effekter på människors hälsa. Därför bör vi aktivt utforska och studera mekanismen för Hsp60 i olika fysiologiska och patologiska tillstånd i människokroppen för att bättre förstå Hsp60:s position och roll i människors hälsa. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt, eftersom Cistanche deserticola har antioxidant-, anti-inflammatoriska och anti-aging-effekter, vilket kan hjälpa till att minska oxidation och inflammatoriska reaktioner i hjärnan och därigenom skydda nervsystemets hälsa. Dessutom kan Cistanche deserticola också främja tillväxt och reparation av nervceller, och därigenom förbättra anslutningen och funktionen hos neurala nätverk. Dessa effekter kan bidra till att förbättra minnet, inlärningsförmågan och tankehastigheten, och kan också förhindra utvecklingen av kognitiv dysfunktion och neurodegenerativa sjukdomar.

Klicka på Vet för att förbättra korttidsminnet

"x"-värdet bestämdes enligt följande: subtrahering av den "x"-vikta Hsp60-signalen från den mitokondriella DNA-signalen i kontrollgruppen gjorde att det mitokondriella DNA-värdet var mindre än eller lika med noll. Signalen för histon H2B multiplicerades med "y".

"y"-värdet bestämdes enligt följande: subtrahering av den "y"-vikta histon-H2B-signalen från kärn-DNA-signalen i kontrollgruppen gjorde att nukleär-DNA-värdet var mindre än eller lika med noll. Om bakgrundssignalen blir hög från multiplikationen, kan kontrasten för den multiplicerade bilden justeras för samma förhållanden i alla sampel.

Bilden av dsDNA-färgning, minus den justerade bilden av multiplicerad Hsp60 och histon H2B, användes för efterföljande analys. Med hjälp av funktionen "Justera-Tröskel" binariserades dessa bilder. Vi valde dsDNA-punktor som sträckte sig i storlek från 2 till 2 0 µm2 (cirkuläritet 0,1–1,0), och de räknades med funktionen "Analysera-analysera partiklar".

2.3. Elektronmikroskopi

En dag före transfektion pläterades HeLa-celler med en densitet av 600 celler/µL. Uttrycket av gener av intresse tystades i HeLa-celler med användning av Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) i Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) enligt tillverkarens instruktioner (med en slutlig RNA-koncentration på 10 nM).

Fyra dagar efter siRNA knockdown utsattes celler för fixering. Cellkulturprover fixerades med 2 % PFA och 2 % glutaraldehyd i 0.1 M fosfatbuffert, pH 7,4, vid 37 ◦C, placerades sedan i en 4 ◦C kylskåp i 30 min. Proverna fixerades i 2 % glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert över natten vid 4 ◦C. Proverna tvättades tre gånger med 0,1 M fosfatbuffert i 30 minuter och efterfixerades med 2% osmiumtetroxid i 0,1 M fosfatbuffert vid 4 ◦C under 1 timme.

Proverna dehydratiserades ingraderade etanollösningar, överfördes till harts (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japan) och polymeriserades vid 60 ◦C i 48 timmar. De polymeriserade hartserna skars i ultratunna 70-nmsektioner med en diamantkniv med användning av en ultramikrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) och monterades sedan på koppargaller.

Sektionerna färgades med 2% uranylacetat vid rumstemperatur under 15 minuter och tvättades med destillerat vatten, följt av sekundärfärgning med en blyfärgningslösning (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) vid rumstemperatur under 3 minuter.

Gallret observerades under ett transmissionselektronmikroskop (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Japan) vid en accelerationsspänning på 80 kV (zebrafiskhjärna) eller 100 kV (cell), och bilder spelades in med en laddningskopplad enhet (CCD)-kamera (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Immunelektronmikroskopi

Proverna på guldskivorna frystes i flytande propan vid -175 ◦C. Efter att proverna frysts in frystes de med 1 % garvsyra i etanol och 2 % destillerat vatten vid -80 ◦C i 24 timmar.

Proverna hölls sedan vid -20 ◦C i 4 timmar, följt av inkubation vid 4 ◦C i 1 timme. Därefter dehydratiserades proverna i vattenfri etanol 3 gånger under 30 minuter. varje gång, följt av infiltration med en 50:50 blandning av etanol och harts (LR white: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) vid 4 ◦C under 1 timme. Proverna överfördes till färskt 100 % harts och inkuberades vid 4 ◦C i 30 minuter, och denna process upprepades tre gånger.

Proverna överfördes till färskt 100 % harts och polymeriserades vid 50 ◦ CO/N. De polymeriserade hartserna var ultratunna sektionerade vid 90 nm med en diamantkniv med användning av en ultramikrotom (Ultracut UCT; Leica), och sektionerna placerades på nickelgaller. Gallren inkuberades med anti-dsDNA-antikropp (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) i 1 % BSA/PBS vid 4 ◦CO/N, följt av tre sköljningar med 1 % BSA/PBS under 1 min vardera.

De inkuberades därefter med denna sekundära antikropp konjugerad till {{0}}nm guldpartiklar (get anti-mus IgG polyklonalantikropp) under 2 timmar vid RT. Efter sköljning med PBS placerades gallren i 2% glutaraldehydein 0,1 M kakodylatbuffert.

Efteråt torkades gallren och färgades sedan med 2 % uranylacetat i 15 minuter och med en blyfärgslösning (Sigma-Aldrich) vid RT under 3 minuter. Gallren observerades genom ett transmissionselektronmikroskop (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) vid en accelerationsspänning på 100 kV. Digitala bilder erhölls med en CCD-kamera (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Resultat

3.1. Minskad TFAM eller GBA inducerar en ökning av ektopiskt mitokondrie-DNA

Först visade vi ett exempel på detektering av mitokondrierhärlett cytoplasmatiskt DNA i HeLa-celler där TFAM-proteinet slogs ner av siRNA (Figur 1A). .

Sekvenspolymorfismer i denna gen rapporteras vara associerade med Parkinsons sjukdom [21,22]. Efter 3 dagar av TFAM-proteinknockdown upptäcktes många dubbelsträngade DNA-punkter i HeLa-cellernas cytoplasma.

Histoner är positiva markörer för nukleärt ursprung DNA i cytoplasman, och negativa markörer för mitokondriellt DNA och mitokondriellt ursprung DNA i cytoplasman [23]. Dessa prickar samlokaliserades inte med histoner, vilket tyder på att de inte var kärnhärlett DNA. Dessutom samlokaliserade några av dessa cytoplasmatiska, ektopiska DNA-punkter inte med Hsp60, en markör för mitokondriella matrisen, vilket indikerar att de fanns utanför mitokondrierna (Figur 1B, C).

Elektronmikroskopi visade också att det ektopiska DNA läckte från mitokondrierna (Figur 2A, B). Sammanfattningsvis berodde ökningen av ektopiska DNA-prickar i cytoplasman av TFAM-knockdown på mitokondriellt DNA som läckte från mitokondrierna. För det andra visade vi ett annat exempel på detektering av mitokondrierhärlett cytoplasmatiskt DNA i HeLa-celler där GBA-protein slogs ner av siRNA (Figur lA).

GBA är den orsakande genen för Gauchers sjukdom, men en heterozygot mutation av GBA är också en riskfaktor för Parkinsons sjukdom [24]. Många dubbelsträngade DNA-prickar upptäcktes i HeLa-cellernas cytoplasma efter 3 dagars GBA-proteinnedbrytning. Vissa DNA-punkter samlokaliserades med histoner, vilket tyder på att de var kärnhärlett DNA.

Andra DNA-punkter samlokaliserades inte med histoner, vilket tyder på att de inte var kärnhärlett DNA utan mitokondrierhärlett DNA (Figur 1D). Sammanfattningsvis berodde ökningen av ektopiska DNA-prickar i cytoplasman av GBA-nedbrytning åtminstone delvis på mitokondriellt DNA som läckte från mitokondrierna.

For more information:1950477648nn@gmail.com